陆军军医大学学报

Gene	Primer sequences
IL-1β	Upstream：5'-AGAAGTACCTGAGCTCGCCA-3' Downstream：5'-GTCCATGGCCACAACAACTG-3'
IL-18	Upstream：5'-CCTCAGACCTTCCAGATCGC-3' Downstream：5'-GGTCCGGGGTGCATTATCTC-3'
β-actin	Upstream：5'-AACCGCGAGAAGATGACCCA-3' Downstream：5'-GAGGTAGTCAGTCAGGTCCC-3'

Gene	Primer sequences
IL-1β	Upstream：5'-AGAAGTACCTGAGCTCGCCA-3' Downstream：5'-GTCCATGGCCACAACAACTG-3'
IL-18	Upstream：5'-CCTCAGACCTTCCAGATCGC-3' Downstream：5'-GGTCCGGGGTGCATTATCTC-3'
β-actin	Upstream：5'-AACCGCGAGAAGATGACCCA-3' Downstream：5'-GAGGTAGTCAGTCAGGTCCC-3'

芍药苷通过调控PI3K/AKT/HIF-1α通路减轻脂多糖诱导的HK-2细胞有氧糖酵解

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谢菁 ¹ , 李若男 ¹ , 高慧慧 ¹ , 杨顺凯 ¹ , 马玉清 ²

陆军军医大学学报 | 论著·基础医学 2025,47(20): 2483-2494

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陆军军医大学学报 |论著·基础医学 2025 , 47 (20) : 2483 -2494

芍药苷通过调控PI3K/AKT/HIF-1α通路减轻脂多糖诱导的HK-2细胞有氧糖酵解

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谢菁¹, 李若男¹, 高慧慧¹, 杨顺凯¹, 马玉清²

作者信息

¹兰州大学：第一临床医学院，甘肃兰州

²兰州大学：第一医院麻醉科，甘肃兰州

通讯作者:

马玉清，E-mail：myq2392466@163.com

MA Yuqing，E-mail：myq2392466@163.com

Paeoniflorin alleviates LPS-induced aerobic glycolysis in HK-2 cells by modulating the PI3K/AKT/HIF-1α pathway

Jing XIE¹, Ruonan LI¹, Huihui GAO¹, Shunkai YANG¹, Yuqing MA²

Affiliations

¹First School of Clinical Medicine，Lanzhou University，Lanzhou，Gansu，China

²Department of Anesthesiology, the First Hospital of Lanzhou University，Lanzhou，Gansu，China

出版时间: 2025-10-30 doi: 10.16016/j.2097-0927.202505035

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摘要

收起

目的

探讨芍药苷（paeoniflorin，PF）对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的肾小管上皮细胞（HK-2细胞）有氧糖酵解的影响及其作用机制。

方法

本研究分为预实验和正式实验两部分。①预实验：体外培养HK-2细胞，CCK-8实验检测细胞活力，RT-qPCR检测炎症因子mRNA的水平，进行LPS最佳造模浓度筛选、芍药苷毒性实验和浓度筛选。正式实验：将HK-2细胞分成对照组（CON组）、LPS组、LPS+PF组和LPS+PF+740Y-P组。通过建立LPS诱导的SA-AKI肾小管细胞损伤的体外模型，分别给予PF和PI3K激活剂740Y-P干预，造模24 h后取材，CCK-8实验检测细胞活力；细胞外酸化率（extra cellular acidification rate，ECAR）试剂盒检测ECAR；ELISA检测IL-1β、IL-18、乳酸（lactic acid，Lac）以及乳酸脱氢酶A（lactate dehydrogenase A，LDHA）；Western blot检测p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、丙酮酸激酶2（pyruvate kinase 2，PKM2）、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）的表达；免疫荧光观察有氧糖酵解关键酶PKM2的表达和分布情况。

结果

①筛选出LPS最佳造模浓度为20.0 μg/mL，芍药苷安全剂量为0~100.0 μmol/L，芍药苷的最佳治疗浓度为25.0 μmol/L。②与CON组相比，LPS组细胞活力明显下降（P<0.05），ECAR明显升高（P<0.05），IL-1β、IL-18、Lac、LDHA水平明显增加（P<0.05），p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、p-PKM2、NLRP3蛋白相对表达量明显增加（P<0.05），细胞核内PKM2荧光强度明显增强（P<0.05）。与LPS组相比，LPS+PF组ECAR明显下降（P<0.05），IL-1β、IL-18、Lac、LDHA水平明显下降（P<0.05），p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、p-PKM2、NLRP3蛋白相对表达量明显减少（P<0.05），细胞核内PKM2荧光强度明显减弱（P<0.05）。与LPS+PF组相比，LPS+PF+740Y-P组ECAR明显升高（P<0.05），IL-1β、IL-18、Lac、LDHA水平明显增加（P<0.05），p-PI3K、p-AKT、HIF-1α、p-PKM2、NLRP3蛋白相对表达量明显增加（P<0.05），细胞核内PKM2荧光强度明显增强（P<0.05）。

结论

芍药苷通过抑制PI3K/AKT/HIF-1α信号通路，降低HK-2细胞有氧糖酵解水平，减轻炎症反应。

关键词

脓毒症相关急性肾损伤 / 有氧糖酵解 / PI3K/AKT/HIF-1α通路 / 芍药苷 / 肾小管上皮细胞

Abstract

收起

Objective

To investigate the effects of paeoniflorin (PF) on lipopolysaccharide (LPS)-induced aerobic glycolysis in renal tubular epithelial cell line HK-2 and its underlying mechanism of action.

Methods

This study consists of a preliminary experiment and a formal experiment. Preliminary experiment: CCK-8 assay and RT-qPCR were used respectively to measure cell viability and mRNA expression levels of inflammatory factors in HK-2 cells after LPS stimulation to determine the optimal LPS concentration for modeling as well as to evaluate the toxicity of PF and screen for its appropriate concentration. Formal experiment: HK-2 cells were divided into control group (CON group), LPS group, LPS+PF group and LPS+PF+740Y-P group. LPS was used to establish a cell model of sepsis associated-acute kidney injury (SA-AKI) in HK-2 cells, and then the cell model was treated with PF and PI3K activator 740Y-P, correspondingly for 24 h. CCK-8 assay was employed to detect cell viability, and Extracellular Acidification Rate (ECAR) Kit was utilized to measure the rate. The contents of IL-1β, IL-18, lactic acid (Lac) and lactate dehydrogenase A (LDHA) were determined with ELISA. Western blotting was applied to detect the expression of p-PI3K, p-AKT, HIF-1α, pyruvate kinase 2 (PKM2, a key enzyme in aerobic glycolysis) and NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3 (NLRP3), and immunofluorescence assay was performed to observe the expression and distribution of PKM2.

Results

① Our preliminary experiment identified that the optimal concentration of LPS for modeling was 20.0 μg/mL, a safe dosage range of PF was 0~100.0 μmol/L, and its optimal therapeutic concentration was 25.0 μmol/L. ② Compared with the CON group, LPS stimulation resulted in significantly decreased cell viability (P<0.05), increased ECAR (P<0.05), elevated contents of IL-1β, IL-18, Lac and LDHA (P<0.05), up-regulated protein levels of p-PI3K, p-AKT, HIF-1α, p-PKM2 and NLRP3 (P<0.05), and enhanced fluorescence intensity of PKM2 in the nucleus of cells (P<0.05). Compared with the model group, PF treatment reversed all above effects induced by LPS stimulation (all P<0.05). Compared with the LPS+PF group, in the LPS+PF+740Y-P group, ECAR was elevated (P<0.05), the contents of IL-1β, IL-18, Lac and LDHA were increased (P<0.05), and the relative expression levels of p-PI3K, p-AKT, HIF-1α, p-PKM2 and NLRP3 were increased (P<0.05), and the fluorescence intensity of PKM2 was strengthened (P<0.05) and enhanced in the nucleus (P<0.05).

Conclusion

PF reduces aerobic glycolysis in HK-2 cells and alleviates the inflammatory response by inhibiting the PI3K/AKT/HIF-1α signaling pathway.

Key words

sepsis associated-acute kidney injury / aerobic glycolysis / PI3K/AKT/HIF-1α pathway / paeoniflorin / renal tubular epithelial cells

引用本文

谢菁, 李若男, 高慧慧, 杨顺凯, 马玉清. 芍药苷通过调控PI3K/AKT/HIF-1α通路减轻脂多糖诱导的HK-2细胞有氧糖酵解. 陆军军医大学学报, 2025 , 47 (20) : 2483 -2494 . DOI: 10.16016/j.2097-0927.202505035

Jing XIE, Ruonan LI, Huihui GAO, Shunkai YANG, Yuqing MA. Paeoniflorin alleviates LPS-induced aerobic glycolysis in HK-2 cells by modulating the PI3K/AKT/HIF-1α pathway[J]. Journal of Army Medical University, 2025 , 47 (20) : 2483 -2494 . DOI: 10.16016/j.2097-0927.202505035

正文

收起

脓毒症相关急性肾损伤（sepsis associated-acute kidney injury，SA-AKI）是脓毒症多器官功能障碍中一种常见且严重的并发症^［1］。据统计，60%的AKI是由严重脓毒症引起^［2］，与非脓毒症所致肾损伤患者相比，SA-AKI患者的临床预后明显更差^［3］，病死率高达30%~70%^［4］。研究表明，SA-AKI发病机制与肾小管上皮细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞等多种细胞的损伤和功能障碍有关，有氧糖酵解和炎症反应也参与SA-AKI的发生发展^［4-6］。

在细胞免疫应答过程中，有氧糖酵解发挥着关键调控作用，是炎症性疾病治疗的新靶点^［7］。SA-AKI患者发生有氧糖酵解时，炎症反应显著加剧^［8］。体内外实验研究发现，在盲肠结扎穿刺（cecal ligation and puncture，CLP）诱导的脓毒症小鼠模型和脂多糖（LPS）刺激HK-2细胞构建的SA-AKI体外模型中，有氧糖酵解终产物及其限速酶的表达上调，特异性抑制有氧糖酵解通路可有效缓解SA-AKI的发展进程^［9-10］。

PI3K/AKT信号通路参与有氧糖酵解的发生^［11-12］，激活PI3K/AKT通路能够上调HIF-1α的表达^［13］。HIF-1α作为关键的转录调控因子，可特异性结合有氧糖酵解关键酶如丙酮酸激酶M2亚型（pyruvate kinase 2，PKM2）和乳酸脱氢酶A（lactate dehydrogenase A，LDHA）的启动子区域，直接调控其转录表达^［14］。但PI3K/AKT/HIF-1α通路是否参与SA-AKI的有氧糖酵解尚无研究。

芍药苷（paeoniflorin，PF）是一种单萜双环苷类化合物，是中药白芍和赤芍的主要活性成分，具有抗炎、免疫调节等作用。XIE等^［15］发现，PF通过PI3K/AKT通路抑制LPS诱导的小鼠单核巨噬细胞炎症反应，但PF能否抑制HK-2细胞有氧糖酵解和炎症反应尚待探究。因此，本研究采用LPS诱导HK-2细胞，建立SA-AKI肾小管细胞损伤的体外模型，探讨PF是否通过调控PI3K/AKT/HIF-1α信号通路，减轻有氧糖酵解和炎症反应。

1　材料与方法

收起

1.1　实验细胞和试剂

人来源的肾小管上皮细胞HK-2购自武汉普诺赛生命科技有限公司。LPS、芍药苷购自美国MCE公司，PI3K特异性激动剂740Y-P购自美国Glpbio公司，IL-1β、IL-18、乳酸（lactic acid，Lac）、LDHA的酶联免疫吸附（ELISA）测定试剂盒购自江苏酶免实业有限公司，细胞外酸化率（extra cellular acidification rate，ECAR）荧光法测试盒购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司，反转录试剂盒、荧光定量试剂盒购自上海翌圣生物科技有限公司，p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、HIF-1α、p-PKM2、PKM2抗体购自美国ImmunoWay公司，NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）抗体购自美国proteintech公司，Actin抗体购于美国GeneTex公司。

1.2　方法

1.2.1　LPS最佳造模浓度、芍药苷毒性实验及其浓度筛选

将HK-2细胞用含10%FBS、1%青霉素-链霉素的MEM培养基，在37 ℃、5%CO₂培养箱中进行培养。待HK-2细胞融合度达到80%时：①筛选LPS最佳造模浓度：分别用不同浓度（0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0 μg/mL）LPS处理24 h，以未处理的细胞作为对照，CCK-8实验检测细胞活力，RT-qPCR检测炎症因子mRNA的水平，筛选LPS最佳造模浓度。②芍药苷毒性实验：分别用不同浓度（12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L）PF处理HK-2细胞24 h，以未处理的细胞作为对照，CCK-8实验检测细胞活力，以评估PF对细胞的毒性作用，确定PF的安全剂量范围。③筛选芍药苷最佳治疗浓度：分为CON组、LPS组、LPS+DMSO组、LPS+PF（12.5 μmol/L）组、LPS+PF（25.0 μmol/L）组、LPS+PF（50.0 μmol/L）组、LPS+PF（100.0 μmol/L）组。其中CON组为未处理的细胞；LPS组用20.0 μg/mL的LPS处理HK-2细胞24 h；LPS+DMSO组作为溶剂对照组，同时加入20.0 μg/mL的LPS，及与LPS等体积的0.1%DMSO处理HK-2细胞24 h；LPS+PF各组用不同浓度（0~100.0 μmol/L）PF处理HK-2细胞4 h后，再给予LPS（20.0 μg/mL）处理24 h，CCK-8实验检测细胞活力，RT-qPCR检测炎症因子mRNA的水平，筛选PF最佳治疗剂量。

1.2.2　正式实验分组

将HK-2细胞分为对照（CON）组、LPS组、LPS+芍药苷（LPS+PF）组、LPS+芍药苷+PI3K激活剂740Y-P（LPS+PF+740Y-P）组。CON组为未处理的细胞；LPS组给予20.0 μg/mL LPS处理24 h；LPS+PF组用25.0 μmol/L PF预处理4 h后，再加入20.0 μg/mL LPS处理24 h；LPS+PF+740Y-P组先用25.0 μmol/L PF和20.0 μmol/L740Y-P^［16］共同预处理4 h后，再加入20.0 μg/mL LPS处理24 h。

1.2.3　CCK-8实验检测细胞活力

将HK-2细胞按照每孔5 000个接种于96孔板中，空白组加入与LPS等体积的PBS，药物组分别给予不同浓度的LPS、PF（按照1.2.1的给药剂量及处理时间），每个浓度设置5个复孔处理24 h，每孔加入10 μL CCK-8染色液，在37 ℃、5%CO₂细胞培养箱中孵育1 h后，利用酶标仪在450 nm处测定光密度值［D （450）］，并计算细胞活力：

细胞 活力 % = D 药物 组 - D 空白 组 D 对照 组 - D 空白 组 × 100 %

1.2.4　RT-qPCR

按照1.2.1的给药剂量及处理时间予以HK-2细胞药物处理后，收集细胞样本，Trizol试剂提取总RNA，使用反转录试剂盒合成cDNA。通过PCR扩增仪（A300，杭州朗基科学仪器有限公司）、荧光定量PCR仪［201901003，鲲鹏基因（北京）科学仪器有限公司］检测完成RT-qPCR过程。目标基因引物序列见表1。

1.2.5　ECAR试剂盒检测ECAR变化

本测试盒使用特异性的探针（Ex/Em：490 nm/535 nm），当细胞外环境的pH发生变化时，探针的荧光值也会相应发生变化。发生酸化的细胞外环境会使探针的荧光值降低，以此来检测细胞外的酸化率。设计测定孔和空白孔，将细胞接种至96孔黑色透底酶标板孔中，接种细胞密度为2×10⁵/mL，每孔100 μL细胞悬液。细胞接种完毕放入37 ℃、5%CO₂培养箱，静置培养过夜后，去除细胞培养液，每孔加入100 μL试剂1；空白孔为不接种细胞的孔。根据实验设计加入相应药物刺激细胞，药物干预完成后，进行下一步实验。接种后细胞，37 ℃避光孵育30 min，同时将荧光酶标仪温度设置为37 ℃。向各孔中加入100 μL工作液，荧光酶标仪于激发波长490 nm、发射波长535 nm处检测各孔荧光值，每隔2~3分钟检测一次，总时间100~120 min，绘制荧光值随时间变化的曲线图，选择线性段计算细胞外酸化率（ECAR）：ECAR =（∆F_测定-∆F_空白）/∆T。其中∆F_测定指测定孔变化荧光值（F1-F2）；∆F_空白指空白孔变化荧光值（F1-F2）；∆T指荧光值变化时间（T2-T1）。

1.2.6　ELISA法检测乳酸（Lac）、乳酸脱氢酶（LDHA）、IL-1β、IL-18水平

收集各组细胞的上清液，按照ELISA试剂盒操作说明书配制试剂和操作。使用酶标仪在450 nm波长处依次读取各孔光密度值［D （450）］。绘制标准曲线，计算各组细胞上清中LDHA、Lac、IL-1β、IL-18的含量。

1.2.7　Western blot检测蛋白表达水平

收集各组细胞，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解液4 ℃充分裂解细胞，以12 000×g离心10 min，取上清。蛋白质定量后，取20 μg蛋白上样进行凝胶电泳分离，转至PVDF膜上。5%脱脂奶粉室温封闭4 ℃过夜，分别加入p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、HIF-1α、p-PKM2、PKM2、NLRP3、β-actin抗体室温孵育1 h。加入二抗羊抗兔IgG（1∶20 000），室温孵育1 h。采用Image J量化条带灰度值，目标蛋白和内参蛋白灰度比值反映蛋白表达量。

1.2.8　免疫荧光检测

将HK-2细胞经爬片种板处理后，PBS清洗，4%多聚甲醛（500 μL/孔）固定15 min，PBS漂洗3次。0.5% Triton X-100（PBS配制）室温通透5 min。PBS浸洗3次（3 min/次），3% BSA（200 μL/孔）37 ℃封闭30 min。一抗（PKM2，1∶200，200 μL/孔）4 ℃过夜孵育，PBS清洗3次（7 min/次）。二抗（山羊抗兔IgG，1∶1 000，500 μL/孔）37 ℃避光孵育1 h，PBS清洗3次（7 min/次）。DAPI染核5 min，PBS清洗3次（5 min/次）。封片后荧光显微镜观察并拍照，使用Image J对图片进行定量，统计平均荧光强度。

1.2.9　统计学分析

采用SPSS 22. 0软件对数据进行统计学分析，采用Graphpad Prism 10.0软件作图。符合正态分布的计量资料以

x ¯

±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

收起

2.1　LPS浓度、芍药苷毒性实验及其浓度筛选

2.1.1　筛选LPS最佳造模浓度

与CON组比较，不同浓度LPS干预HK-2细胞24 h后，5.0~40.0 μg/mL LPS对细胞活力有明显影响（P<0.05，图1A），并呈剂量依赖性下降趋势。与CON组比较，不同浓度LPS干预HK-2细胞24 h后，10.0~40.0 μg/mL LPS组IL-1β、IL-18 mRNA水平明显升高（P<0.05，图1B、C）。结合CCK-8实验和RT-qPCR结果，选择20.0 μg/mL LPS作为最佳造模浓度。

2.1.2　芍药苷（PF）毒性实验

与CON组比较，芍药苷干预24 h后，除200.0 μmol/L的PF显著降低细胞活力（P<0.05），其余不同浓度的芍药苷对细胞活力无明显影响（图1D）。因此确定PF安全药物浓度为0~100.0 μmol/L。

2.1.3　筛选芍药苷（PF）最佳治疗剂量

与CON组比较，LPS组明显降低细胞活力（P<0.05）；与LPS组比较，不同浓度PF处理后，细胞活力有不同程度的增加（P<0.05）。其中，LPS+PF（25.0 μmol/L）组细胞活力最高（P<0.05），见图1E。与CON组比较，LPS组IL-1β、IL-18 mRNA水平明显升高（P<0.05），见图1B、C。与LPS组比较，不同浓度PF处理后，IL-1β、IL-18 mRNA水平明显下降（P<0.05），其中LPS+PF（25.0 μmol/L）组炎症因子mRNA水平下降最明显，故选择25.0 μmol/L作为PF的最佳治疗剂量，见图1F、G。

2.2　PF可降低LPS引起的细胞外酸化率升高

在相同时间段内，与CON组比较，LPS组荧光值降低，细胞外酸化率明显升高（P<0.05）；与LPS组比较，LPS+PF组荧光值明显升高，细胞外酸化率明显下降（P<0.05）；与LPS+PF组比较，LPS+PF+740Y-P组荧光值明显降低，细胞外酸化率明显升高（P<0.05），见图2。

2.3　PF可降低LPS引起的有氧糖酵解水平及炎症因子含量的升高

与CON组比较，LPS组LDHA、Lac、IL-1β、IL-18表达明显增加（P<0.05）；与LPS组比较，LPS+PF组LDHA、Lac、IL-1β、IL-18表达明显减少（P<0.05）；与LPS+PF组比较，LPS+PF+740Y-P组LDHA、Lac、IL-1β、IL-18表达明显增加（P<0.05），见图3。

2.4　PF可降低LPS引起的NLRP3蛋白表达升高

与CON组比较，LPS组NLRP3蛋白相对表达量显著升高（P<0.05）；与LPS组比较，LPS+PF组NLRP3蛋白相对表达量显著下降（P<0.05）；与LPS+PF组比较，LPS+PF+740Y-P组NLRP3蛋白相对表达量显著升高（P<0.05），见图4。

2.5　PF可抑制LPS引起的PI3K/AKT/HIF-1α通路的激活

与CON组比较，LPS组p-PI3K、p-AKT及HIF-1α蛋白相对表达量显著增多（P<0.05）；与LPS组比较，LPS+PF组p-PI3K、p-AKT及HIF-1α蛋白相对表达量显著减少（P<0.05）；与LPS+PF组比较，LPS+PF+740Y-P组p-PI3K、p-AKT及HIF-1α蛋白相对表达量显著增多（P<0.05），见图5。

2.6　PF可降低LPS引起的PKM2蛋白表达升高

与CON组比较，LPS组p-PKM2蛋白相对表达量显著升高（P<0.05）；与LPS组比较，LPS+PF组p-PKM2蛋白相对表达量显著下降（P<0.05）；与LPS+PF组比较，LPS+PF+740Y-P组p-PKM2蛋白相对表达量显著升高（P<0.05），见图6。

2.7　PF可降低LPS引起的细胞核PKM2表达上调

与CON组比较，LPS组免疫荧光显示PKM2表达明显上调（P<0.05），且胞质与胞核中呈现不同程度的分布，大多数PKM2定位于细胞核内，细胞质内PKM2分布相对较少；与LPS组比较，LPS+PF组免疫荧光显示PKM2表达明显下调（P<0.05），定位于细胞核内的PKM2显著减少，细胞质内PKM2分布相对增多；与LPS+PF组比较，LPS+PF+740Y-P组免疫荧光显示PKM2表达明显上调（P<0.05），定位于细胞核内的PKM2显著增多，细胞质内PKM2分布相对减少，见图7。

3　讨论

收起

本研究以HK-2细胞作为研究对象，使用LPS建立SA-AKI肾小管细胞损伤的体外模型。采用CCK-8实验评估细胞活力，RT-qPCR法检测炎症因子IL-1β、IL-18的mRNA水平，以筛选LPS最佳造模剂量。LPS造模24 h后，HK-2细胞炎症因子IL-1β、IL-18、有氧糖酵解关键酶PKM2、LDHA及其产物Lac表达上调，ECAR明显升高，证明SA-AKI肾小管细胞损伤的体外模型成功建立。

本实验在筛选PF的最佳治疗剂量时，发现50.0、100.0 μmol/L的治疗效果较25.0 μmol/L差，考虑可能是PF在培养基中的溶解度或细胞摄取机制（如转运蛋白）在25.0 μmol/L时已达饱和，更高浓度可能导致药物聚集或非特异性结合，降低了生物利用度。

3.1　脓毒症期间代谢重编程具有细胞特异性，HK-2细胞代谢模式呈现阶段性变化

在脓毒症期间，细胞能量代谢从氧化磷酸化转变为糖酵解，这种现象被称为代谢重编程^［17］。研究表明，在脓毒症引起的多器官损伤中，由Toll样受体（Toll like receptors，TLRs）介导的先天免疫和炎症反应发挥关键作用^［18-20］，TLR涉及代谢重编程的调控^［21］。值得注意的是，脓毒症期间代谢重编程并非涉及所有细胞，而是具有细胞类型特异性。研究发现，TLR配体（如革兰阴性菌的脂多糖LPS）可诱导巨噬细胞^［22］、树突状细胞^［20-22］和淋巴细胞^［23］的代谢转换，从氧化磷酸化转变为有氧糖酵解。心肌细胞虽仍依赖氧化磷酸化，但可能因全身缺氧或微循环障碍导致功能抑制^［24］。

研究发现，脓毒症期间肾小管上皮细胞的代谢变化呈现阶段性特征^［25］，在早期阶段，由于肾脏微循环障碍导致的缺氧以及TNF-α等炎症信号激活HIF-1α，促使糖酵解增强，糖酵解酶表达上调；同时，内毒素（LPS）、活性氧（ROS）和钙超载引起线粒体功能障碍，导致电子传递链受损和ATP合成减少。进入后期阶段，肉碱棕榈酰转移酶1（carnitine palmitoyltransferase1，CPT1）等关键酶表达下调，脂肪酸氧化（fatty acid oxidation，FAO）受到抑制，脂肪酸供能减少，从而加剧能量危机；此时细胞通过激活自噬途径降解受损线粒体（线粒体自噬）来维持能量平衡，但过度激活的自噬可能进一步导致细胞凋亡或坏死。

3.2　PF可通过抑制有氧糖酵解缓解SA-AKI肾小管上皮细胞损伤

PKM2通过调控有氧糖酵解影响脓毒症的炎症反应^［26-27］。PKM2是有氧糖酵解的关键酶，存在二聚体或四聚体两种活性形式。二聚体状态时，其催化活性降低，PKM2以二聚体形式发生核转位后，可与转录因子HIF-1α相互作用，协同激活HIF-1α下游靶基因［如葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter 1，GLUT1）、LDHA等］的转录表达，这种调控作用显著促进有氧糖酵解的发生，形成正反馈^［28］。LDHA作为糖酵解途径最后一步的关键酶，催化丙酮酸生成乳酸^［29］。乳酸是有氧糖酵解过程中的关键代谢产物，可以反映细胞代谢水平^［30］，且乳酸增加直接促进SA-AKI的发展进程^［31］。因此本研究选择PKM2、LDHA、Lac作为评估有氧糖酵解发生的指标。

本研究结果显示，LPS组p-PKM2蛋白表达上调，给予PF处理后，p-PKM2蛋白表达下调。采用免疫荧光检测HK-2细胞PKM2的表达及分布情况，结果发现，LPS组PKM2的荧光强度在细胞核内显著增强，经过PF处理后，其荧光强度明显减弱，因此推测PF可能通过调控PKM2核转位影响有氧糖酵解。同时发现，LPS组ECAR升高，有氧糖酵解关键酶LDHA、终产物Lac水平上升；给予PF处理后，HK-2细胞ECAR降低，LDHA、Lac水平下降。AN等^［31］研究表明，在CLP诱导的SA-AKI小鼠模型和LPS刺激的HK-2细胞中，乳酸产生增加。在LPS诱导的脓毒症小鼠模型中，PF可以通过上调SIRT1表达，抑制PKM2介导的有氧糖酵解^［32］。PF可以下调PKM2和LDHA的表达，减少巨噬细胞乳酸分泌，降低有氧糖酵解水平^［33］。这些研究发现与本实验结果高度一致。因此，在SA-AKI肾小管细胞损伤的体外模型中，PF可以一定程度地抑制有氧糖酵解。

3.3　PF可通过抑制有氧糖酵解减轻LPS诱导的HK-2细胞炎症反应

有氧糖酵解会影响NLRP3炎症小体的激活^［34］，NLRP3炎症小体激活后，介导IL-1β和IL-18的成熟和释放，导致炎症级联反应^［35］。限制有氧糖酵解可减少脓毒症早期炎症因子释放，减轻炎症反应^［36-37］。本研究发现，给予PF处理后，有氧糖酵解关键酶PKM2、LDHA表达下调，Lac生成减少，同时，NLRP3蛋白表达和炎症因子IL-1β、IL-18减少，表明PF可以抑制有氧糖酵解和NLRP3炎症小体激活，减轻炎症反应。LI等^［38］研究表明，PF显著抑制了脓毒症急性肝损伤大鼠NLRP3炎症小体激活及炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-18的表达。但PF调控有氧糖酵解，影响炎症反应的机制仍然不详。

3.4　PF通过抑制PI3K/AKT/HIF-1α信号通路，减轻LPS诱导的HK-2细胞的有氧糖酵解和炎症反应

为了进一步探究PF减轻有氧糖酵解的机制，本研究在PF干预基础上使用PI3K特异性激活剂740Y-P处理HK-2细胞。结果发现，有氧糖酵解关键酶PKM2、LDHA、终产物Lac的水平及ECAR反而升高；同时，NLRP3蛋白表达上调，炎症因子IL-1β、IL-18含量升高，表明740Y-P逆转了PF减轻有氧糖酵解及炎症反应的作用。此外，本研究还发现，LPS组通路蛋白p-PI3K、p-AKT、HIF-1α蛋白表达上调；给予PF处理后，p-PI3k、p-AKT、HIF-1α蛋白表达下调；经740Y-P处理后，通路蛋白p-PI3k、p-AKT、HIF-1α蛋白表达反而升高。因此，本研究认为PI3K/AKT/HIF-1α通路参与SA-AKI肾小管细胞损伤的体外模型有氧糖酵解和炎症反应的发生。

综上所述，PF减轻LPS诱导的HK-2细胞的有氧糖酵解和炎症反应，其机制是通过抑制PI3K/AKT/HIF-1α信号通路发挥作用。

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2025年第47卷第20期

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doi: 10.16016/j.2097-0927.202505035

接收时间：2025-05-15
首发时间：2026-10-30
出版时间：2025-10-30

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出版历史

收稿日期：2025-05-15
修回日期：2025-09-24

基金

作者信息

¹兰州大学：第一临床医学院，甘肃兰州

²兰州大学：第一医院麻醉科，甘肃兰州

通讯作者:

马玉清，E-mail：myq2392466@163.com

MA Yuqing，E-mail：myq2392466@163.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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