陆军军医大学学报

基因	引物序列（5'→3'）
SNTB1	上游：CTGGAAGTGAAGTACATGCGAG
下游：GGGATGCTTTTCCGGTCTCTG
β-actin	上游：GTTGTCGACGACGAGCG
下游：GCACAGAGCCTCGCCTT
miR-543	上游：GGAAACATTCGCGGTGC
下游：GTGCGTGTCGTGGAGTCG
U6	上游：GGAACGATACAGAGAAGATTAGC
下游：TGGAACGCTTCACGAATTTGCG

基因

引物序列（5'→3'）

SNTB1

上游：CTGGAAGTGAAGTACATGCGAG

下游：GGGATGCTTTTCCGGTCTCTG

β-actin

上游：GTTGTCGACGACGAGCG

下游：GCACAGAGCCTCGCCTT

miR-543

上游：GGAAACATTCGCGGTGC

下游：GTGCGTGTCGTGGAGTCG

上游：GGAACGATACAGAGAAGATTAGC

下游：TGGAACGCTTCACGAATTTGCG

基因	引物序列（5'→3'）
SNTB1	上游：CTGGAAGTGAAGTACATGCGAG
下游：GGGATGCTTTTCCGGTCTCTG
β-actin	上游：GTTGTCGACGACGAGCG
下游：GCACAGAGCCTCGCCTT
miR-543	上游：GGAAACATTCGCGGTGC
下游：GTGCGTGTCGTGGAGTCG
U6	上游：GGAACGATACAGAGAAGATTAGC
下游：TGGAACGCTTCACGAATTTGCG

基因

引物序列（5'→3'）

SNTB1

上游：CTGGAAGTGAAGTACATGCGAG

下游：GGGATGCTTTTCCGGTCTCTG

β-actin

上游：GTTGTCGACGACGAGCG

下游：GCACAGAGCCTCGCCTT

miR-543

上游：GGAAACATTCGCGGTGC

下游：GTGCGTGTCGTGGAGTCG

上游：GGAACGATACAGAGAAGATTAGC

下游：TGGAACGCTTCACGAATTTGCG

变量	例数	HR（95%CI）	P
T分期
T1+T2	131	1.000
T3	435	2.742（1.545~14.864）	< 0.001
T4	74	7.590（3.987~14.447）	< 0.001
未知	3
N分期
N0	367	1.000
N1	153	1.667（1.123~2.473）	0.011
N2	119	4.322（3.030~6.164）	< 0.001
未知	4
M分期
M0	474	1.000
M1	89	5.577（3.945~7.884）	< 0.001
未知	80
SNTB1 mRNA表达	643	1.325（1.120~1.566）	< 0.001

变量

例数

HR（95%CI）

T分期

T1+T2

131

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435

2.742（1.545~14.864）

< 0.001

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SNTB1 mRNA表达

643

1.325（1.120~1.566）

< 0.001

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变量

例数

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2.742（1.545~14.864）

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< 0.001

未知

N分期

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< 0.001

未知

M分期

474

1.000

5.577（3.945~7.884）

< 0.001

未知

SNTB1 mRNA表达

643

1.325（1.120~1.566）

< 0.001

miR-543/SNTB1轴调控结直肠癌免疫微环境

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张敏 ¹ , 李敏 ¹ , 肖猛 ¹ , 陈才 ² , 郑小菊 ¹^,³ , 雷雨广 ¹^,³

陆军军医大学学报 | 基础医学 2025,47(13): 1484-1493

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陆军军医大学学报 |基础医学 2025 , 47 (13) : 1484 -1493

miR-543/SNTB1轴调控结直肠癌免疫微环境

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张敏¹, 李敏¹, 肖猛¹, 陈才², 郑小菊¹^,³, 雷雨广¹^,³

作者信息

¹信阳职业技术学院：医学院，河南信阳

²信阳职业技术学院：药学院，河南信阳

³信阳市中医院病理科，河南信阳

通讯作者:

张敏，E-mail：470361625@qq.com

ZHANG Min，E-mail：470361625@qq.com

MiR-543/SNTB1 axis modulates immune microenvironment in colorectal cancer

Min ZHANG¹, Min LI¹, Meng XIAO¹, Cai CHEN², Xiaoju ZHENG¹^,³, Yuguang LEI¹^,³

Affiliations

¹School of Medicine, Xinyang Hospital of Traditional Chinese Medicine，Xinyang，Henan，China

²School of Pharmaceutical Sciences，Xinyang Vocational and Technical College，Xinyang，Henan, Xinyang Hospital of Traditional Chinese Medicine，Xinyang，Henan，China

³Department of Pathology, Xinyang Hospital of Traditional Chinese Medicine，Xinyang，Henan，China

出版时间: 2025-07-15 doi: 10.16016/j.2097-0927.202504078

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摘要

收起

目的

探讨miR-543/互养蛋白β1（syntrophin beta 1，SNTB1）轴在结直肠癌（colorectal cancer，CRC）中的临床意义及其对免疫微环境的影响。

方法

收集癌症基因组图谱（the Cancer Genome Atlas，TCGA）、基因型组织表达（Genotype-Tissue Expression，GTEx）、人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas，HPA）等公开数据对CRC组织中SNTB1的表达进行分析，并通过Kaplan-Meier生存分析、单因素Cox回归分析及相关性分析评估SNTB1在CRC患者中的预后价值及其与免疫微环境的关系。在线数据库结合CRC细胞HT-29荧光活性实验检测miR-543与SNTB1的靶向关系。CRC细胞HT-29经过相应处理后（转染si-SNTB1、miR-543 mimics或/和SNTB1过表达质粒）与CD8⁺ T细胞构建体外共培养体系，分别采用RT-qPCR、Western blot、流式细胞术、ELISA以及乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）释放实验检测miR-543、SNTB1的表达以及CD8⁺ T细胞的活性及细胞毒性。

结果

对公共数据库的分析显示SNTB1在CRC中的表达显著高于正常组织（P<0.001）；相较于SNTB1低表达组，SNTB1高表达的患者预后较差（P<0.05）。SNTB1高表达与CRC肿瘤微环境免疫评分以及CD8⁺T细胞等免疫细胞的浸润呈负相关关系（P<0.05），且在HT-29细胞中敲减SNTB1可增强CD8⁺T细胞的杀伤力（P<0.01）。在线数据库结合细胞实验证实了miR-543和SNTB1的靶向结合关系，同时miR-543在CRC中表达降低（P<0.001）。转染miR-543 mimic可抑制HT-29细胞中SNTB1的表达（P<0.001），而过表达SNTB1可逆转miR-543 mimic对CD8⁺ T细胞体外杀伤能力的促进效应（P<0.05）。

结论

miR-543可通过与SNTB1的靶向结合促进CD8⁺ T细胞的活化并增强其对HT-29细胞的杀伤力。

关键词

miR-543 / 结直肠癌 / 互养蛋白β1 / 肿瘤免疫微环境

Abstract

收起

Objective

To investigate the clinical significance of the miR-543/syntrophin beta 1 (SNTB1) axis in colorectal cancer (CRC) and its influence on the tumor immune microenvironment.

Methods‍

The expression of SNTB1 in CRC tissues was analyzed using public data, such as, The Cancer Genome Atlas (TCGA), Genotype-Tissue Expression (GTEx), and Human Protein Atlas (HPA). Then Kaplan-Meier survival analysis, univariate Cox regression analysis and correlation analysis were performed to evaluate the prognostic value of SNTB1 and its relationship with immune microenvironment in CRC. The targeting relationship between miR-543 and SNTB1 was confirmed through online databases and fluorescence assays in HT-29 cells. For in vitro experiments, after transfecting si-SNTB1, miR-543 mimics and/or SNTB1 overexpression plasmids, HT-29 cells were co-cultured with CD8⁺ T cells, the expression of miR543 and SNTB1 and the viability and cytotoxicity of CD8⁺ T cells were assessed with qRT-PCR, Western blotting, flow cytometry, ELISA, and lactate dehydrogenase (LDH) release assay.

Results‍

Analysis of public databases revealed significantly higher expression of SNTB1 in CRC tissues than normal tissues (P<0.001). The CRC patients with high SNTB1 expression exhibited poorer prognosis when compared with those with low expression level (P<0.05). Moreover, high SNTB1 expression was negatively correlated with immune scores in the tumor microenvironment and immune cell infiltration, especially CD8⁺ T cells (P<0.05). Furthermore, Knockdown of SNTB1 in HT-29 cells enhanced the cytotoxic activity of CD8⁺ T cells (P<0.01). Online database and in vitro experiments confirmed that miR-543 targets SNTB1, while the expression of miR-543 was decreased in colorectal cancer (P<0.001). Transfection with the miR-543 mimic inhibited the expression of SNTB1 in HT-29 cells (P<0.001), while overexpressing SNTB1 counteracted the promotion effect of miR-543 mimics on CD8⁺ T cell-mediated cytotoxicity (P<0.05).

Conclusion‍

MiR-543 activates CD8⁺ T cells and enhances their cytotoxicity against HT-29 cells by directly targeting SNTB1.

Key words

miR-543 / colorectal cancer / SNTB1 / tumor immune microenvironment

引用本文

张敏, 李敏, 肖猛, 陈才, 郑小菊, 雷雨广. miR-543/SNTB1轴调控结直肠癌免疫微环境. 陆军军医大学学报, 2025 , 47 (13) : 1484 -1493 . DOI: 10.16016/j.2097-0927.202504078

Min ZHANG, Min LI, Meng XIAO, Cai CHEN, Xiaoju ZHENG, Yuguang LEI. MiR-543/SNTB1 axis modulates immune microenvironment in colorectal cancer[J]. Journal of Army Medical University, 2025 , 47 (13) : 1484 -1493 . DOI: 10.16016/j.2097-0927.202504078

正文

收起

据2022年中国癌症发病情况统计显示结直肠癌（colorectal cancer，CRC）的发病率和死亡率均位列前五，给公共卫生带来了重大挑战^［1］。随着癌症研究的深入，肿瘤微环境这一领域逐渐成为研究者关注的焦点。研究表明，肿瘤细胞与其微环境中的免疫细胞发生相互作用，形成复杂的免疫逃逸机制，从而促进肿瘤的转移和耐药性^［2-3］。因此寻找新的生物标志物和治疗靶点，对肿瘤的个性化诊疗和改善预后具有重要的临床意义。互养蛋白β1（syntrophin beta1，SNTB1）是Syntrophin基因家族的一个成员，其编码蛋白质为一种衔接蛋白，可为细胞的跨膜信号转导提供平台^［4］。研究发现，SNTB1与CRC的进展密切相关，例如CRC组织中可检测到SNTB1的表达明显升高，且高表达SNTB1的患者预后较差；同时细胞实验和裸鼠移植瘤实验证实SNTB1可能通过负调控PKN2激活ERK/AKT信号，进而促进CRC的进展^［5］。在结肠腺癌中，SNTB1可通过调控SRC激活Hippo-YAP信号促进癌细胞的侵袭转移^［6］。然而这些研究多是从细胞功能学的角度探索SNTB1在CRC中的作用，并聚焦于其下游调控机制^［5-7］，尚无具体论著说明SNTB1是否对肿瘤微环境产生影响。基于此，本研究采用生物信息学结合实验验证的方式分析了SNTB1与CRC进展及患者预后的关系，同时探索了其上游可能的调控靶点以及二者对CRC肿瘤微环境和CD8⁺ T细胞的影响。

1　材料与方法

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1.1　主要仪器与试剂

酶标仪（xMark）、Western blot小型垂直电泳转印系统购自美国Bio-Rad公司；流式细胞仪（Accuri™ C6 Plus）购自美国BD公司；实时定量PCR系统（ABI7500）购自美国Thermo公司；DMEM细胞培养液及胎牛血清购自南京生航生物公司；EasySep人CD8⁺T细胞正选试剂盒（17853）购自北京诺为生物公司；Dynabeads人T活化剂CD3/CD28（11161D）购自美国Thermo Fisher Scientific公司；Lipofectamine^TM3000及相关转染试剂购于美国Invitrogen公司；TRIzol试剂（KGF5101）购自江苏凯基生物公司；SNTB1（ab242046）、β-actin（ab8227）及HRP标记二抗（ab6721）购自美国Abcam公司；CD69-PE流式抗体（310905）、CD25-APC流式抗体（302609）购自美国BioLegend公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（11402ES60）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）细胞毒性检测试剂盒（40209ES76）购自上海翌圣生物公司；人TNF-α（EK182）、INF-γ（EK180）、IL-2（EK102）的ELISA Kit 检测试剂盒购自杭州联科生物公司；SYBR Premix ExTaq^TMⅡ试剂盒购自日本TaKaRa公司；miR-543 mimics及对照阴性miR（miR-543和miR-NC）、野生型及突变型SNTB1基因3′UTR-荧光素酶表达载体（SNTB1-WT和SNTB1-MUT）、SNTB1小分子干扰RNA及其对照siRNA（si-SNTB1和si-NC）的构建和合成由湖北百奥斯生物公司提供；SNTB1表达质粒及其对照质粒（SNTB1和Ne）购自上海Origene公司。

1.2　公共数据库数据获取及分析

由基于基因表达水平值的交互式分析平台（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）数据库在线获取人体各组织器官中SNTB1表达的交互式图谱；收集并下载癌症基因组图谱（the Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库中CRC项目下miRNA-seq、RNA-seq数据以及患者相应的临床数据，同时收集基因型组织表达（Genotype-Tissue Expression，GTEx）数据库中正常结直肠组织样本的表达谱数据。在R软件中对所有数据进行清洗、整理后，分析SNTB1以及miR-543在肿瘤组织及正常组织中的差异表达情况。进一步使用R软件中的survival包对二者的表达及患者生存情况进行比例风险假设检验并拟合生存回归，绘制Kaplan-Meier生存曲线。肿瘤组织及正常组织中SNTB1的蛋白表达数据由人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas，HPA）数据库获取。

1.3　 SNTB1与结直肠癌免疫微环境关系的评估

通过R软件提取TCGA数据库中CRC项目下SNTB1的表达谱数据以及113种免疫检查点基因的表达谱数据，并对其进行相关性分析，其中免疫检查点基因是通过检索Pubmed数据库并对相关文献进行整理后收集所得^［8-10］。采用ESTIMATE算法对CRC微环境基质评分、免疫评分和ESTIMATE总评分进行计算，并据此评估SNTB1的表达与CRC免疫微环境评分的关系。进一步采用Cibersort算法和ssGSEA算法评估结直肠癌微环境中免疫细胞的浸润情况，并分析SNTB1的表达与免疫细胞浸润之间的关系。

1.4　细胞培养及转染

人正常肠上皮细胞NCM460和CRC细胞系（HT-29、SW480、LoVo）购自武汉尚恩生物技术有限公司。所有细胞常规培养于含10%胎牛血清和1%青-链霉素双抗的DMEM细胞液，置于37 ℃、5%CO₂中。

细胞转染依据试剂盒说明书进行操作。转染前将细胞接种至无血清培养液横纵同步化12 h后，用Lipofectamine^TM3000转染试剂将相应质粒转入HT-29细胞中，48 h后，收集细胞测定转染效率并用于后续实验。

检测miR-543和SNTB1的靶向调控关系，分组如下：空白对照（Ctrl）组、转染阴性对照miR（miR-NC）组和转染miR-543 mimics（miR-543 mimics）组。

检测HT-29细胞中miR-543/SNTB1轴对共培养体系CD8⁺ T细胞的影响，分组如下：转染阴性对照siRNA（si-NC）组、转染SNTB1小分子干扰RNA（si-SNTB1）组、转染阴性对照miR和SNTB1表达的对照质粒（miR-NC+Ne）组、转染miR-543 mimics和SNTB1表达的对照质粒（miR-543+Ne）组、转染miR-543 mimics和SNTB1表达质粒（miR-543+SNTB1）组。

1.5　RT-qPCR实验

用TRIzol试剂提取各组总RNA，并进行逆转录以获得cDNA，利用SYBR Premix ExTaq^TMⅡ试剂盒进行实时定量PCR检测，反应程序设定：95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，循环40次。检测结果以U6或β-actin为内参，采用2^-△△Ct法对各组miR-543或SNTB1的相对表达进行半定量分析。引物序列如表1所示。

1.6　Western blot检测

依据文献［11］进行操作。用RIPA裂解提取细胞总蛋白并进行Western blot电泳和电转操作。含有蛋白条带的PVDF膜经5%脱脂奶粉室温封闭30 min后，加入一抗［SNTB1（1∶2 000）和β-actin（1∶10 000）］4 ℃孵育过夜。漂洗后，室温孵育HRP标记二抗（1∶10 000）90 min。用ECL化学发光试剂显像蛋白条带，用Image J软件以β-actin为内参对SNTB1的表达进行半定量分析。

1.7　CD8⁺T细胞分离、激活和共培养

CD8⁺T细胞由人外周血单个核细胞中分选得到，人外周血单个核细胞购自上海联组生物科技有限公司（LZ-YX9435）。具体操作如下：将人外周血单核细胞消化后转移至新的离心管中，根据操作说明采用EasySep人CD8⁺ T细胞正选试剂盒分选出CD8⁺ T细胞，再经Dynabeads人T活化剂CD3/CD28处理24 h，测定纯度后用于后续实验操作。共培养体系的构建：依据实验设计预先对HT-29细胞进行相关转染操作，各转染组HT-29细胞与经过CD3/CD28激活的CD8⁺T细胞按10：1的效靶比进行共培养，48 h后收集细胞或上清液进行后续检测。

1.8　流式细胞术

通过流式细胞术对T细胞表面激活标志物CD69和CD25进行分析，具体操作如下：收集CD8⁺T细胞并添加FACS缓冲液予以重悬，采用anti-CD69（1∶200）和anti-CD25（1∶200）流式抗体在冰盒中避光孵育30 min，洗涤重悬细胞，经流式细胞仪检测、采集数据，采用FlowJo 10.8.2软件解析CD8⁺T细胞膜表面CD69和CD25的表达情况，据此评估CD8⁺ T细胞的活化。

1.9　ELISA分析

收集各组共培养体系中的上清液，依据ELISA试剂盒的操作手册检测其中TNF-α、INF-γ和IL-2含量，并据此评估CD8⁺ T细胞的效应功能。

1.10　LDH释放实验

采用LDH释放实验评估CD8⁺ T细胞（效应细胞）对HT-29细胞（靶细胞）的细胞毒性作用。具体操作如下：各样品处理组均依据方法1.4中实验分组进行相应处理，同时另设：空白对照组（只含细胞培养液）、样品对照组（只含HT-29细胞）、样品最大酶活性对照组（只含用于后续裂解的HT-29细胞），做好相应的标记。按照说明书，各孔分别取100 μL上清液并转移至新96孔板中，再加入10 μL LDH检测工作液避光孵育20 min，测定光密度［D（490）］值。依据以下公式计算细胞毒性：细胞毒性=（D_{样品处理组}-D_{样品对照组}）/（D_{样品最大酶活性对照组}-D_{样品对照组}）×100%。

1.11　 SNTB1靶点预测与验证

结合starBase v2.0和TargetScan Human 8.0预测SNTB1的上游靶miRNA，并依据二者在3'UTR区域的互补结合序列设计野生型（SNTB1-WT）和突变型（SNTB1-MUT）荧光素酶报告基因质粒。将其分别与miR-NC或miR-543共同转染至HT-29细胞中，参照荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书要求对各组细胞裂解物荧光素酶的活性进行检测以评估miR-543与SNTB1的靶向关系。

1.12　统计学分析

线上数据库数据采用R4.3.3软件和相应的网站进行分析及可视化；细胞实验数据采用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析及可视化。符合正态分布的计量资料表示为

x ¯

±s，多组间比较采用one-way ANOVA分析，两组间比较采用独立样本t检验；不符合正态分布的计量资料表示为M（P₂₅，P₇₅），组间比较采用χ²检验。以P<0.05认为差异具有统计学意义。

2　结果

收起

2.1　CRC中SNTB1的表达升高且与患者不良预后相关

GEPIA数据库获取人体各组织器官中SNTB1表达的交互式图谱如图1A所示：可见SNTB1在脑、肾、结直肠及子宫等多种肿瘤组织中的表达显著高于正常组织，提示SNTB1在某些肿瘤中可能发挥促癌作用。联合TCGA和GTEx数据，进一步分析SNTB1在结肠癌（colon adenocarcinoma，COAD）和直肠腺癌（rectum adenocarcinoma，READ）中的转录表达情况，结果显示，相较于正常组织，COAD和READ肿瘤组织中SNTB1的表达均显著升高（P<0.001，图1B）。用HPA数据库中的SNTB1免疫组化结果进行分析比对，相较于正常组织，肿瘤组织中的SNTB1蛋白表达水平明显升高（图1E）。以上结果提示：在CRC中，SNTB1呈显著高表达，为其作为CRC的潜在治疗靶点提供了强有力的证据。

收集合并TCGA数据库CRC患者（COAD和READ）的临床资料和生存数据并进行分析，结果显示相较于SNTB1高表达组，SNTB1低表达组患者具有更长的总生存期（P=0.042，图1C）和无进展生存期（P<0.001，图1D）。同时纳入患者TNM分期数据及SNTB1的表达数据进行预后单因素回归分析，结果显示SNTB1的表达可作为预测患者不良预后的独立指标（表2）。

2.2　 SNTB1高表达的CRC患者肿瘤微环境的免疫活性较低

SNTB1与免疫检查点基因表达之间的相关性分析表明，SNTB1的表达与CD24、CD47、转化生长因子β受体1（transforming growth factor beta receptor 1，TGFBR1）、癌胚抗原相关的细胞黏附分子（carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1，CEACAM1）等免疫抑制因子具有一定的相关性（图2A），提示SNTB1可能影响CRC免疫微环境的构建。

通过ESTIMATE算法评估SNTB1的表达与CRC免疫微环境的关系，结果显示：SNTB1的表达与免疫评分（r=-0.25，P<0.001）以及ESTIMATE评分（r=-0.14，P<0.001）均呈一定的负相关关系（图2B~D）。

进一步采用Cibersort和ssGSEA算法对SNTB1的表达与常见免疫细胞的浸润进行相关性验证分析。Cibersort算法的结果显示：SNTB1表达与浆细胞（r=-0.09，P=0.03）、调节性T细胞（r=-0.21，P<0.001）、CD8⁺ T细胞（r=-0.18，P<0.001）等免疫细胞浸润呈现一定的负相关（图2E）。ssGSEA算法的结果显示：SNTB1表达与19种免疫细胞浸润呈现一定的负相关（图2F），其中主要包括B细胞（r=-0.17，P<0.001）、DC细胞（r=-0.18，P<0.001）、中性粒细胞（r=-0.09，P=0.027）、CD8⁺ T细胞（r=-0.08，P=0.04）。从以上两种算法的评估结果可以看出SNTB1表达与CD8⁺ T细胞在结直肠癌组织中的浸润富集得分呈负相关。

以上结果提示，SNTB1的高表达预示着CRC患者肿瘤微环境具有较低的免疫活性，且可能参与抑制CD8⁺ T细胞的功能。

2.3　miR-543靶向调控SNTB1

为进一步探讨SNTB1在CRC中的调控网络，本研究通过StarBase在线数据库探索了可能影响SNTB1表达的上游miRNA，并对其在CRC中的表达进行相关性分析，结果表明miR-543与SNTB1的表达呈负相关（r=-0.130，P=0.005，图3A、B），且miR-543在结直肠癌中的表达显著降低（P<0.001，图3C）。此外，Kaplan-Meier生存分析的结果显示：在CRC中，miR-543低表达患者的总生存期和无进展生存期表现较差（P=0.006，图3D、E）。

通过体外细胞实验对3株常用CRC细胞系HT-29、SW480、LoVo中SNTB1和miR-543的表达进行验证，结果显示：相较于NCM460，miR-543在3株CRC细胞中均呈现一定程度的低表达（P<0.001），而SNTB1则表现出不同程度的高表达（P<0.001，图4A、B）。TargetScan数据库结果显示miR-543与SNTB1 3′UTR区存在7-mer结合位点（图4C），且双荧光素酶活性实验显示HT-29细胞中miR-543 mimics显著抑制野生型（WT组）报告载体的荧光素酶活性，证实miR-543是通过靶向SNTB1发挥调控作用（图4D）。此外，RT-qPCR和Western blot实验证实，在HT-29细胞中转染miR-543 mimics可抑制SNTB1的表达（P<0.001，图4E、F）。

2.4　HT-29细胞中miR-543靶向SNTB1促进CD8⁺ T细胞活化并增强其细胞毒性

结合前期对肿瘤免疫微环境及免疫细胞浸润的分析，本研究进一步通过体外细胞共培养实验验证miR-543/SNTB1轴对CRC免疫微环境CD8⁺ T细胞的作用。结果显示：转染si-SNTB1可显著抑制HT-29细胞中SNTB1的表达（P<0.01，图5A、B），且转染si-SNTB1的HT-29细胞与CD8⁺ T细胞共培养可促进CD8⁺T细胞表面CD69和CD25的表达（P<0.01，图5C、D），上调上清液中TNF-α（P<0.001，图5E）、INF-γ（P<0.001，图5F）和IL-2（P<0.01，图5G）等细胞因子的水平，同时提升CD8⁺T细胞对HT-29细胞的体外杀伤效应（P<0.001，图5H）。结果证实敲减SNTB1可促进CD8⁺ T细胞的活化并增强其体外杀伤作用。此外，相较于miR-NC+Ne组，转染miR-543 mimics的HT-29细胞（即miR-543+Ne组）与CD8⁺ T细胞构建的共培养体系中的CD8⁺ T细胞表面CD69和CD25的表达明显升高（P<0.05，图5C、D）；ELISA结果显示，miR-543 mimics组构建的共培养体系上清液中TNF-α、INF-γ和IL-2的水平均明显升高（P<0.05，图5E~G），且CD8⁺ T细胞对HT-29细胞的体外杀伤效应显著提升（P<0.001，图5H）。然而，相较于miR-543 mimics+Ne组，共转染SNTB1表达质粒可逆转miR-543 mimics对共培养体系中CD8⁺ T细胞的影响（P<0.05，图5C~G）。以上结果说明，SNTB1是miR-543的靶点，CRC细胞过表达miR-543可通过靶向SNTB1促进CD8⁺ T细胞活化并增强其对CRC细胞的杀伤作用（图6）。

3　讨论

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3.1　 SNTB1在CRC中可发挥促癌作用并参与调控肿瘤免疫微环境

现有研究表明SNTB1在CRC中表达上调，且可能发挥促癌作用^［5-7］；然而其在CRC中的具体作用以及其对CRC免疫微环境的影响尚不清晰。本研究对TCGA、GTEx以及HPA等数据库的大量数据进行综合分析，证实了SNTB1在CRC中呈高表达，且高表达SNTB1的患者具有较差的预后总生存期和无进展生存期；同时纳入患者TNM分期数据及SNTB1的表达数据进行预后单因素回归分析，显示SNTB1的表达可作为预测患者不良预后的独立指标。这一结果与前期的研究具有一致性^［5-6］，也为SNTB1成为CRC预后生物标志物的潜力提供了一定的理论基础。

Syntrophin家族调节癌症进展的各个步骤，如肿瘤生长、转移、治疗抵抗、免疫逃逸和肿瘤干性^{［5-7，12-13］}。如在肺癌中，SNTG2与免疫细胞浸润和免疫检查点抑制具有相关性^［12］。敲低SNTB1可通过调控β-catenin信号抑制CRC肿瘤干性和进展^［13］。本研究据此对CRC中SNTB1与肿瘤微环境和肿瘤免疫之间的关系进行探索，结果发现结直肠癌中SNTB1的表达与某些免疫抑制因子具有相关性，且与患者免疫微环境评分和免疫细胞浸润，特别是CD8⁺ T细胞的免疫浸润呈负相关。CD8⁺ T细胞属于关键的细胞毒性T细胞，在肿瘤免疫应答过程中，能够识别表达特定抗原的肿瘤细胞，激活后可分泌多种细胞因子，例如TNF-α、INF-γ和IL-2等来增强免疫反应，并诱导肿瘤细胞的凋亡^［14-17］。本研究通过体外细胞实验证实，在HT-29细胞中，敲低SNTB1可促进CD8⁺ T细胞的活化，促进TNF-α、INF-γ和IL-2等细胞因子的释放，并增强其对HT-29的体外杀伤作用。以上结果提示在CRC中，SNTB1参与免疫微环境的构建，且可通过抑制CD8⁺ T细胞在免疫逃逸中发挥作用；这可能是其发挥促癌作用的其中一个原因。

3.2　miR-543可调控SNTB1在CRC中发挥作用

此外，本研究进一步对SNTB1的上游调控靶点进行了探索和分析，结合数据库预测和实验验证证实miR-543是SNTB1的上游调控microRNA。研究表明，miR-543在CRC组织中高表达^［18］；且在非小细胞肺癌中，MEG3/miR-543/IDO信号轴与肿瘤细胞自噬和免疫反应密切相关^［19］。本研究的结果显示，在CRC细胞HT-29中，miR-543可靶向抑制SNTB1的表达；同时miR-543mimics可促进共培养体系中CD8⁺ T细胞的活化并增强其体外杀伤效应，而过表达SNTB1则可逆转miR-543 mimic对CD8⁺ T细胞体外杀伤能力的促进效应。这为进一步理解SNTB1在CRC进展中的作用机制，特别是其在肿瘤免疫反应中的作用提供了新的视角，也为开发针对SNTB1的免疫治疗策略提供了理论基础。后续可通过临床样本的收集与验证为SNTB1临床应用价值提供更为丰富和稳健的实验依据。

综上所述，在CRC中SNTB1的表达上调，且高表达SNTB1的患者预后总生存期和无进展生存期均较短，同时SNTB1的高表达与CRC微环境较低的免疫活性相关，提示SNTB1可能成为评估CRC进展与预后的潜在生物标志物。此外，miR-543是SNTB1的上游调控miRNA，miR-543/SNTB1轴可影响结直肠癌微环境中CD8⁺ T细胞的活化和体外杀伤作用。

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2025年第47卷第13期

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doi: 10.16016/j.2097-0927.202504078

接收时间：2025-04-18
首发时间：2026-10-28
出版时间：2025-07-15

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出版历史

收稿日期：2025-04-18
修回日期：2025-06-20

基金

作者信息

¹信阳职业技术学院：医学院，河南信阳

²信阳职业技术学院：药学院，河南信阳

³信阳市中医院病理科，河南信阳

通讯作者:

张敏，E-mail：470361625@qq.com

ZHANG Min，E-mail：470361625@qq.com

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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