陆军军医大学学报

甲基莲心碱通过抑制ROS/NLRP3/Caspase-1通路减少小胶质细胞焦亡并改善帕金森病神经炎症

PDF下载

刘纷纷 ¹ , 冯丹 ¹ , 刘韵 ¹ , 左方娅 ¹ , 郭修红 ² , 刘钰淇 ¹ , 陈兰兰 ³ , 王玉洁 ¹ , 田锦勇 ⁴

陆军军医大学学报 | 神经科学·论著 2025,47(23): 2933-2942

收起

陆军军医大学学报 |神经科学·论著 2025 , 47 (23) : 2933 -2942

甲基莲心碱通过抑制ROS/NLRP3/Caspase-1通路减少小胶质细胞焦亡并改善帕金森病神经炎症

全屏

刘纷纷¹, 冯丹¹, 刘韵¹, 左方娅¹, 郭修红², 刘钰淇¹, 陈兰兰³, 王玉洁¹, 田锦勇⁴

作者信息

¹贵州中医药大学研究生院，贵州贵阳

²清镇市第一人民医院重症医学科，贵州贵阳

³遵义医科大学研究生院，贵州遵义

⁴贵州省人民医院全科医学科，贵州贵阳

通讯作者:

田锦勇，E-mail：tjy8877@163.com

TIAN Jinyong，E-mail：tjy8877@163.com

Neferine attenuates parkinson’s disease via modulating microglial pyroptosis mediated by ROS/NLRP3/Caspase-1 signaling pathway

Fenfen LIU¹, Dan FENG¹, Yun LIU¹, Fangya ZUO¹, Xiuhong GUO², Yuqi LIU¹, Lanlan CHEN³, Yujie WANG¹, Jinyong TIAN⁴

Affiliations

¹Graduate School，Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang，Guizhou

²Department of Critical Care Medicine，the First People’s Hospital of Qingzhen City，Guiyang，Guizhou

³Graduate School，Zunyi Medical University，Zunyi，Guizhou

⁴Department of General Practice，Guizhou Provincial People’s Hospital，Guiyang，Guizhou，China

出版时间: 2025-12-15 doi: 10.16016/j.2097-0927.202509003

文章导航

摘要

收起

目的

证实甲基莲心碱（neferine，Nef）通过抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS）/NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）/Caspase-1通路介导的小胶质细胞焦亡，从而改善帕金森病（Parkinson’s disease，PD）症状。

方法

将小鼠小胶质细胞BV2分为对照组、脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）-三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）组、LPS-ATP+Nef组，采用1 μg/mL LPS联合5 mmol/L ATP诱导小胶质细胞焦亡，对LPS-ATP诱导的小胶质细胞给予2 μmol/L Nef预处理。取18只10~12周龄C57BL/6雄性小鼠（体质量22~25 g），采用计算机随机数生成法将小鼠分为：对照组（n=6）、1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）组（n=6）、MPTP+Nef组（n=6）。采用流式细胞仪检测细胞焦亡，CCK-8检测细胞活力，2'，7'-二氯荧光素二乙酸酯（2'，7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）探针表征ROS，试剂盒检测丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）。应用ELISA法及Western blot检测白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）及白介素18（interleukin-18，IL-18），免疫荧光及免疫组化检测NLRP3及Caspase-1表达，免疫组化检测酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）蛋白表达。采用苏木素-伊红染色试剂盒观察脑组织病理学变化。采用小鼠神经功能缺损评分（modified neurological severity score，mNSS）评价小鼠神经功能损伤。

结果

LPS-ATP组与对照组相比，细胞活力降低（P=0.002），细胞焦亡增加（P<0.001），ROS（P<0.001）、MDA（P<0.001）、IL-1β（P<0.001）、IL-18（P<0.001）水平升高，NLRP3（P<0.001）和Caspase-1（P<0.001）表达上调，GSH水平（P<0.001）和SOD活性（P<0.001）降低。LPS-ATP+Nef组与LPS-ATP组比较，细胞活力增强（P=0.047），细胞焦亡减少（P<0.001），ROS（P=0.002）、MDA（P<0.001）、IL-1β（P<0.001）、IL-18（P=0.004）水平降低，NLRP3（P<0.001）及Caspase-1（P<0.001）表达下调，GSH水平（P<0.001）及SOD活性（P<0.001）升高。小鼠实验表明：MPTP组与对照组相比，mNSS得分（P<0.001）及组织ROS水平（P<0.001）增加，TH蛋白下调（P<0.001），NLRP3（P<0.001）及Caspase-1（P<0.001）表达上调，而Nef处理可明显抑制上述MPTP对小鼠的影响（P<0.05）。在组织病理学方面，对照组小鼠海马神经元分布均匀，细胞核结构清晰，MPTP组表现为部分神经元肿胀，出现间质水肿、核萎缩，而MPTP+Nef组神经元损伤有所改善。

结论

Nef通过ROS/NLRP3/Caspase-1通路抑制小胶质细胞焦亡，从而有效改善PD神经炎症及组织损伤。

关键词

帕金森病 / 细胞焦亡 / 小胶质细胞 / 甲基莲心碱

Abstract

收起

Objective

To demonstrate that neferine (Nef) alleviates Parkinson’s disease (PD) by inhibiting microglial pyroptosis mediated through the reactive oxygen species (ROS)/NOD-like receptor protein 3 (NLRP3)/Caspase-1 pathway.

Methods

BV2 microglial cells were divided into: control group, lipopolysaccharides (LPS)-adenosine triphosphate (ATP) group, and LPS-ATP+Nef group. Pyroptosis was induced by 1 μg/mL LPS + 5 mmol/L ATP, with 2 mmol/L Nef pretreatment. Eighteen 10-12-week-old male C57BL/6 mice (22~25 g) were randomly assigned to: control (n=6), 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) (n=6), and MPTP+Nef (n=6) groups. Detection methods included: flow cytometry for pyroptosis, Cell Counting Kit-8 (CCK-8) for viability, 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) for ROS, commercial kits for malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD), glutathione (GSH), ELISA/Western blot for interleukin-1β (IL-1β)/IL-18, immunofluorescence/immunohistochemistry for NLRP3/Caspase-1, tyrosine hydroxylase (TH) immunohistochemistry, hematoxylin-eosin staining for neuropathology, and modified neurological severity score (mNSS).

Results

Versus control, LPS-ATP group showed decreased viability (P=0.002), increased pyroptosis (P<0.001), elevated ROS (P<0.001)/MDA (P<0.001)/IL-1β (P<0.001)/IL-18 (P<0.001), upregulated NLRP3 (P<0.001)/Caspase-1 (P<0.001), and reduced GSH (P<0.001)/SOD (P<0.001). Nef treatment reversed these effects (all P<0.05). According to the results of murine studies, compared with the control group, the MPTP group had increased mNSS (P<0.001)/tissue ROS (P<0.001), downregulated TH (P<0.001), upregulated NLRP3 (P<0.001)/Caspase-1 (P<0.001). Nef treatment significantly attenuated the MPTP-induced deleterious effects (P<0.05). Histopathological analysis revealed that control group exhibited uniformly distributed hippocampal neurons with distinct nuclear morphology; MPTP group showed neuronal swelling, interstitial edema, and nuclear atrophy; MPTP+Nef group demonstrated ameliorated neuronal damage.

Conclusion

Nef inhibits microglial pyroptosis via ROS/NLRP3/Caspase-1 axis, ameliorating PD neuroinflammation and pathology.

Key words

Parkinson’ s disease / pyroptosis / microglia / neferine

引用本文

刘纷纷, 冯丹, 刘韵, 左方娅, 郭修红, 刘钰淇, 陈兰兰, 王玉洁, 田锦勇. 甲基莲心碱通过抑制ROS/NLRP3/Caspase-1通路减少小胶质细胞焦亡并改善帕金森病神经炎症. 陆军军医大学学报, 2025 , 47 (23) : 2933 -2942 . DOI: 10.16016/j.2097-0927.202509003

Fenfen LIU, Dan FENG, Yun LIU, Fangya ZUO, Xiuhong GUO, Yuqi LIU, Lanlan CHEN, Yujie WANG, Jinyong TIAN. Neferine attenuates parkinson’s disease via modulating microglial pyroptosis mediated by ROS/NLRP3/Caspase-1 signaling pathway[J]. Journal of Army Medical University, 2025 , 47 (23) : 2933 -2942 . DOI: 10.16016/j.2097-0927.202509003

正文

收起

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是第二大神经退行性疾病，其临床特征主要表现为进行性运动功能障碍^［1-3］。据统计，全球约1 000万人受PD影响，且其患病率随年龄增长而升高^［4］。临床资料显示，近30年来PD发病率呈上升趋势^［5］。因此，深入研究PD的发病机制并探索有效的治疗策略具有重要临床意义。

细胞焦亡是一种由gasdermin介导的细胞程序性死亡方式，典型的细胞焦亡途径由炎性小体介导，炎性小体在结构上通常包含Nod样受体（Nod-like receptor，NLR）或AIM2样受体蛋白（AIM2-like receptor，ALR）、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC）、Caspase-1前体蛋白^［6-9］。在焦亡过程中，炎性小体促进Caspase-1前体蛋白裂解为活化型Caspase-1，后者可进一步切割gasdermin以裂解为N端gasdermin（N-GSDMD）及C端gasdermin（C-GSDMD），N-GSDMD可在细胞膜上形成非选择性膜孔，从而促进水流入及细胞裂解；同时Caspase-1催化白介素1β（interleukin-1β，IL-1β）及白介素18（interleukin-18，IL-18）的前体裂解为成熟形式，并通过N-GSDMD膜孔释放至胞外，诱发细胞焦亡^［10-12］。

小胶质细胞作为中枢神经系统中的常驻巨噬细胞，在清除病原体和维持脑内稳态中发挥关键作用^［13-16］。小胶质细胞焦亡在PD发病过程中具有重要意义。在PD动物模型和细胞模型中均观察到小胶质细胞焦亡的激活，抑制该过程可减轻神经炎症反应，并逆转多巴胺能神经元丢失和运动行为缺陷^［15-17］。此外，小胶质细胞焦亡受活性氧（reactive oxygen species，ROS）/NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）/Caspase-1通路正向调控，而抑制ROS/NLRP3/Caspase-1通路可有效干扰小胶质细胞焦亡的发生^［18-20］。因此，ROS/NLRP3/Caspase-1通路有望成为抑制小胶质细胞焦亡并改善PD症状的重要靶点。

甲基莲心碱（neferine，Nef）是荷花绿色胚芽的主要成分，具有抗炎、抗氧化、抗血小板等生物活性，在癌症、心血管疾病、睡眠不足等疾病的治疗中发挥重要作用^［21-23］。动物模型显示，Nef可有效抑制神经退行性疾病突变蛋白表达，改善模型小鼠的运动缺陷^［24］。然而，目前仍不明确Nef对PD的治疗作用及确切机制。既往证据指出，Nef可通过ROS/NLRP3/Caspase-1通路抑制内皮细胞氧化应激及细胞焦亡^［25］，提示ROS/NLRP3/Caspase-1通路可能是Nef发挥抗炎及抗氧化作用的关键靶点。同时，鉴于ROS/NLRP3/Caspase-1通路对小胶质细胞焦亡的重要影响，本研究推测在PD中ROS/NLRP3/Caspase-1通路介导Nef对小胶质细胞焦亡的抑制作用。

鉴于此，本研究拟采用脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）联合三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）诱导的小胶质细胞模型，以及1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）诱导的小鼠PD模型，探讨Nef对PD的治疗作用，并着重探究其在调控小胶质细胞焦亡中的作用，以期明确Nef的作用靶点，为PD治疗提供新的机制见解和候选药物。

1　材料与方法

收起

1.1　材料

小鼠小胶质细胞BV2细胞购自中国普诺赛公司；10~12周龄C57BL/6雄性小鼠购自中国维通利华（北京）公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；青-链霉素混合液及杜氏改良Eagle培养基（dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）高糖培养基、ATP购自中国生工生物公司；MPTP购自美国Sigma Aldrich公司。LPS及Nef购自美国MedChemExprss公司；聚偏氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜购自中国索莱宝生物公司；FAM-FLICA Caspase-1（YVAD）检测试剂盒及碘化丙锭染剂购自美国ImmunoChemistry Technologies公司；CCK-8试剂盒、小鼠IL-1β ELISA试剂盒、小鼠IL-18 ELISA试剂盒、丙二醛（MDA）检测试剂盒、GSH检测试剂盒、SOD活性检测试剂盒（WST-8法）、免疫染色封闭液、DCFH-DA探针、DAPI染色液、苏木素伊红（HE）染色试剂盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）检测试剂盒、Western blot封闭液、增强型化学发光底物（enhanced chemilumines-cence，ECL）显色试剂均购自中国碧云天生物公司；4%多聚甲醛、荧光素偶联的山羊抗兔抗体、柠檬酸盐修复液、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）交联的Boost免疫组化检测试剂（山羊抗兔）、HRP交联的二抗、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体均购自美国Cell signaling公司；NLRP3、Caspase-1抗体、IL-1β抗体、IL-18抗体均购自美国Arigobio公司；5-溴-2’-脱氧尿苷（5-bromo-2'-deoxyuridine，BrdU）抗体及神经元细胞核抗原（neuronal nuclei，NeuN）抗体购自美国Abcam公司；酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）抗体购自中国三鹰生物公司。

1.2　方法

1.2.1　细胞培养及处理

细胞培养基配置如下：10%胎牛血清+1%青-链霉素混合液+DMEM高糖培养基。小鼠小胶质细胞BV2细胞培养于细胞培养基中，孵育箱环境条件设置为37 ℃、5%CO₂。取生长状况良好的BV2细胞，分为对照组、LPS-ATP组、LPS-ATP+Nef组。对照组细胞正常培养，不接受LPS-ATP诱导及Nef给药。LPS-ATP组采用LPS联合ATP诱导细胞焦亡，使用1 μg/mL LPS联合5 mmol/L ATP诱导24 h。LPS-ATP+Nef组预先给予2 μmol/L Nef处理4 h，后采用LPS联合ATP诱导细胞焦亡。

1.2.2　CCK-8法检测细胞活力

取BV2细胞并接种于96孔板，进行实验分组及处理。然后，每孔加入CCK-8溶液，37 ℃孵育1 h。采用酶标仪检测450 nm处光密度［D（450）］值，计算细胞活力。

1.2.3　流式细胞术检测细胞焦亡

消化、收集细胞后，PBS溶液重悬细胞，1 000×g离心细胞5 min，移除上清液，采用FAM-FLICA Caspase-1（YVAD）检测试剂盒标记焦亡细胞。加入碘化丙锭染剂，室温避光复染5 min，使用流式细胞仪表征细胞焦亡。

1.2.4　ELISA法检测IL-1β及IL-18水平

采用ELISA检测细胞培养上清液中IL-1β及IL-18含量。收集细胞培养基，100×g离心5 min，取上清，使用小鼠IL-1β ELISA试剂盒或小鼠IL-18 ELISA试剂盒检测，检测步骤严格遵循产品使用说明书。

1.2.5　细胞氧化应激指标水平检测

为评估细胞的氧化应激水平，本研究收集各组细胞样品，并检测丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽（glutathione，GSH），所用试剂盒包括MDA检测试剂盒、SOD活性检测试剂盒、GSH检测试剂盒，操作步骤严格遵循产品使用指南。

1.2.6　免疫荧光法检测蛋白水平

为检测细胞中的NLRP3及Caspase-1蛋白，取细胞样品，去除培养基，4%多聚甲醛室温固定细胞15 min。移除固定液并洗涤细胞。为表征海马组织中的NLRP3及Caspase-1蛋白，取海马CA1区石蜡组织切片，脱蜡水化后置于柠檬酸钠缓冲液（pH=6.0）中，使用微波炉加热20 min，冷却至室温后使用0.1% Triton X-100进行通透处理。

加入含5%正常羊血清的封闭液封闭1 h。移除封闭液并洗涤后，加入NLRP3（稀释度1∶100）或Caspase-1抗体（1∶100）或BrdU抗体（稀释度1∶300）或NeuN（稀释度1∶100），4 ℃孵育过夜。移除一抗并洗涤。加入荧光素偶联的山羊抗兔抗体（稀释度1∶400），室温避光孵育1 h。DAPI染色液复染细胞核，中性树胶封片。荧光显微镜下观察荧光成像。

1.2.7　PD小鼠模型构建

本研究以C57BL/6雄性小鼠（体质量22~25 g，10~12周龄）为PD造模对象。小鼠自由饮食饮水，饲养湿度为（60±1）%，温度为（22±1）℃，12 h光暗交替循环。小鼠经适应性饲养1周后进行实验处理。采用计算机随机数生成法将小鼠为对照组、MPTP组、MPTP+Nef组（n=6）。MPTP组：腹腔注射25 mg/kg MPTP，每天1次，连续注射7 d。MPTP+Nef组：腹腔注射25 mg/kg MPTP，连续注射7 d，最后1次MPTP注射1.5 h后进行Nef腹腔注射，20 mg/kg，持续5 d。对照组：腹腔注射与MPTP等量的生理盐水，持续7 d，后连续腹腔注射与Nef等量的生理盐水，持续5 d。

1.2.8　小鼠神经功能缺损评分（Modified Neurological Severity Score，mNSS）

本研究采用改良mNSS对小鼠的神经损伤进行量化。评分在造模后24 h于安静环境下进行，由不知分组的研究人员通过观察小鼠的自发运动、行走姿态及前爪伸展等行为进行判定。具体标准如下：0分（无异常），1分（对侧前爪无法伸展），2分（爬行时向对侧转圈），3分（行走时向对侧倾倒），4分（无法行走或意识丧失）。得分越高，表明神经功能损伤越严重。

1.2.9　细胞/组织ROS检测

本研究使用活性氧检测试剂盒（DCFH-DA探针）检测细胞及组织样品中的ROS含量，DCFH-DA探针溶于无血清培养基，最终浓度为10 μmol/L。取各组小胶质细胞样品，去除细胞培养基，加入DCFH-DA探针，37 ℃孵育细胞20 min。激光共聚焦显微镜观察荧光成像，表征荧光强度，计算ROS相对变化。为检测海马组织中的ROS含量，取小鼠海马组织，匀浆，离心后弃上清，加入DCFH-DA探针溶液重悬沉淀，37 ℃孵育20 min。激光共聚焦显微镜检测，激发波长488 nm，发射波长525 nm。

1.2.10　海马组织病理学染色

收集小鼠海马体组织CA1区，脱水、石蜡包埋、切片。取石蜡组织切片，脱蜡、水化，采用苏木素伊红染色试剂盒进行组织病理学染色，染色步骤严格遵循产品说明书。染色结束后采用中性树胶封片，显微镜下观察组织病理学变化。

1.2.11　免疫组化检测NLRP3、Caspase-1、TH

为评估海马组织中的炎症小体活性，采用免疫组化检测海马CA1区NLRP3、Caspase-1蛋白；为检测黑质区多巴胺能神经元的变化，采用免疫组化检测黑质区冠状位脑切片中的TH蛋白。取小鼠相应脑片的石蜡切片，脱蜡水化后置于柠檬酸钠缓冲液（pH6.0）中，使用微波炉高火加热至沸腾后转为中低火保持微沸20 min。自然冷却至室温后加入用PBS配制的3%过氧化氢溶液，室温孵育10 min。PBS冲洗3次，每次5 min。加入含5%正常羊血清的封闭液，室温封闭1 h。封闭结束后，加入NLRP3抗体（稀释度1∶100）或Caspase-1抗体（稀释度1∶100）或TH抗体（稀释度1∶500），4 ℃孵育过夜。PBS冲洗3次，每次5 min。加入HRP交联的Boost免疫组化检测试剂，室温孵育30 min。DAB试剂显色，显色完成后立即将切片放入蒸馏水中终止反应。用苏木精染液复染细胞核，流水冲洗返蓝。脱水和中性树胶封片后，于显微镜下观察。

1.2.12　Western blot检测IL-1β及IL-18蛋白水平

取细胞或海马组织样品，使用RIPA裂解液进行裂解。待充分裂解后4 ℃下以12 000×g离心10 min，取上清液。BCA检测试剂盒用于上清液中蛋白浓度检测。取蛋白样品，并加入上样缓冲液，混匀后95 ℃下加热蛋白10 min，后通过SDS-PAGE凝胶电泳系统进行蛋白分离，湿式转膜仪进行蛋白冰转。待蛋白转移至PVDF膜后，加入封闭液，室温摇床振荡1 h。封闭结束后，加入一抗，4 ℃孵育过夜。一抗孵育结束后，加入二抗（稀释度1∶10 000），室温孵育1 h。采用ECL显色试剂进行显色处理。上机，获取蛋白条带图像。以GAPDH为内参，计算蛋白相对水平。一抗产品信息及稀释度如下：IL-1β抗体（稀释度1∶1 000）、IL-18抗体（稀释度1∶1 000）、GAPDH抗体（稀释度1∶1 000）。

1.3　统计学分析

使用GraphPad Prism 9.0软件进行数据绘图，使用SPSS 23.0软件进行统计学分析。实验数据以

x ¯

±s表示。采用单因素方差分析进行组间比较，事后两两比较为Tukey检验。统计学分析均为双尾检验。P<0.05表明差异具有统计学意义。

2　结果

收起

2.1　Nef抑制LPS-ATP诱导的小胶质细胞焦亡

为探究Nef对LPS-ATP诱导小胶质细胞损伤的影响，本研究采用CCK-8检测细胞活力，采用流式细胞仪检测细胞焦亡率。CCK-8实验显示，对照组［（100.92±4.62）%］、LPS-ATP组［（67.07±6.45）%］、LPS-ATP+Nef组［（83.23±7.65）%］的细胞活力差异存在统计学意义（F=21.250，P<0.01），其中LPS-ATP组细胞活力低于对照组（P=0.002），LPS-ATP+Nef组细胞活力高于LPS-ATP组（P=0.047）。细胞焦亡检测结果显示，LPS-ATP组焦亡率高于对照组（P<0.001），LPS-ATP+Nef组焦亡率低于LPS-ATP组（P<0.001）。结果提示Nef抑制LPS-ATP诱导的小胶质细胞焦亡（图1）。

2.2　Nef抑制LPS-ATP诱导的小胶质细胞氧化应激及炎症反应

为进一步探究Nef对LPS-ATP诱导小胶质细胞氧化损伤和炎症反应的影响，本研究采用DCFH-DA荧光探针标记细胞内ROS，应用ELISA检测MDA、SOD、GSH、IL-1β、IL-18。DCFH-DA探针荧光结果显示，LPS-ATP组DCFH探针荧光强度较对照组增加（P<0.001），LPS-ATP+Nef组与LPS-ATP组相比，DCFH探针荧光强度降低（P=0.002，图2A）。LPS-ATP组与对照组相比，MDA升高（P<0.001），SOD（P<0.001）及GSH（P<0.001）降低。LPS-ATP+Nef组与LPS-ATP组相比，MDA降低（P<0.001），SOD（P<0.001）及GSH（P<0.001）升高，差异具有统计学意义（P<0.001，图2B~D）。ELISA实验结果显示，LPS-ATP组与对照组相比，IL-1β（P<0.001）及IL-18升高（P<0.001），LPS-ATP+Nef组与LPS-ATP组相比，IL-1β（P<0.001）及IL-18（P<0.001，图2E）降低。以上结果提示Nef抑制LPS-ATP诱导的小胶质细胞氧化应激及炎症反应。

2.3　Nef抑制LPS-ATP诱导的焦亡相关蛋白表达

为探究Nef对LPS-ATP诱导的焦亡相关蛋白表达的影响，本研究采用免疫荧光检测NLRP3、Caspase-1表达，并使用Western blot检测IL-1β、IL-18表达。免疫荧光结果显示，LPS-ATP组NLRP3及Caspase-1表达多于对照组（P<0.001），LPS-ATP+Nef组NLRP3及Caspase-1表达少于LPS-ATP组（P<0.001，图3A、B）。Western blot结果表明，LPS-ATP组IL-1β（P<0.001）及IL-18（P<0.001）的相对表达量显著高于对照组，LPS-ATP+Nef组IL-1β（P<0.001）及IL-18（P=0.004）的相对表达量显著低于LPS-ATP组（图3C）。以上结果提示Nef抑制LPS-ATP诱导的焦亡相关蛋白表达。

2.4　Nef缓解MPTP诱导的小鼠PD症状

为探究Nef对PD小鼠的影响，本研究使用mNSS评分评估神经功能损伤，采用免疫组化检测TH蛋白、HE染色观察海马组织病理学变化、免疫荧光检测海马组织中的BrdU及NeuN蛋白。mNSS评分结果显示，MPTP组神经损伤得分高于对照组（P<0.001），MPTP+Nef组神经损伤得分低于MPTP组（P<0.001，图4A）。DCFH-DA检测脑组织ROS结果表明，MPTP组ROS相对量较对照组升高（P<0.001），MPTP+Nef组与MPTP组相比ROS相对量（P<0.001，图4B）降低。由此可见，对照组ROS生成低于MPTP组，MPTP+Nef组ROS生成低于MPTP组。

此外，本研究使用免疫组化检测黑质区TH的表达。结果显示，MPTP组脑黑质中TH表达显著低于对照组（P<0.001），MPTP+Nef组脑黑质中TH表达高于MPTP组（P<0.001，图4C）。组织病理学染色结果显示，对照组海马CA1区神经元分布均匀，胞核结构清晰，MPTP组海马组织CA1区中神经元肿胀，且伴随有间质水肿及核萎缩，MPTP+Nef组海马组织CA1区神经元损伤较MPTP组有所改善（图4D）。本研究应用NeuN⁺标记神经元，并检测与NeuN共定位的增殖标记物BrdU，以评估神经元生长情况。MPTP组BrdU⁺NeuN⁺细胞显著少于对照组（P<0.001），而MPTP+Nef组BrdU⁺NeuN⁺细胞多于MPTP组（P=0.025，图4E）。以上结果提示Nef缓解MPTP诱导的小鼠PD症状。

2.5　Nef抑制MPTP诱导的PD小鼠焦亡通路激活

为进一步验证Nef是否通过抑制焦亡缓解PD，本研究采用免疫组化检测NLRP3、Caspase-1表达，采用ELISA检测IL-1β、IL-18含量。免疫组化结果显示，MPTP组海马体组织CA1区中NLRP3及Caspase-1表达高于对照组（P<0.001），MPTP+Nef组海马体组织CA1区中NLRP3及Caspase-1表达低于MPTP组（P<0.001，P=0.002，图5A）。ELISA结果显示，MPTP组IL-1β及IL-18含量高于对照组，MPTP+Nef组IL-1β及IL-18含量低于MPTP组（P<0.001，图5B）。以上结果提示Nef抑制MPTP诱导的PD小鼠焦亡通路激活。

3　讨论

收起

3.1　Nef通过抑制小胶质细胞焦亡改善PD神经炎症

Nef作为一种主要的双苄基异奎林生物碱，在神经退行性变疾病中表现出神经保护潜力。YIN等^［26］研究证实，Nef可通过减轻脑组织中的炎症反应和氧化应激水平，改善神经退行性病理变化。LIN等^［27］研究显示，Nef处理可抑制小胶质细胞中促炎因子的形成及释放。本研究在此基础上，进一步证实Nef可抑制LPS-ATP诱导的小胶质细胞焦亡，并表现出明显的抗炎活性。小胶质细胞焦亡在PD发病机制中具有重要作用。一方面，小胶质细胞发生细胞焦亡，引起促炎细胞因子向胞外释放并引发神经炎症；另一方面，小胶质细胞焦亡也导致小胶质细胞的吞噬作用受限，加剧神经损伤^［28］。本研究动物实验显示，Nef治疗能减轻PD小鼠的多巴胺能神经元的损伤，并降低脑组织中的促炎细胞因子水平及ROS含量。上述结果表明，Nef可能通过减少小胶质细胞焦亡抑制神经炎症，进而改善PD症状。

3.2　Nef通过抑制ROS/NLRP3/Caspase-1通路减轻小胶质细胞焦亡

ROS/NLRP3/Caspase-1通路是调控细胞焦亡的关键机制之一。ROS可促进NLRP3炎性小体的组装及Caspase-1的活化。目前观点认为，ROS通过促进NLRP3炎性小体形成而诱导活化型Caspase-1产生，后者可切割gasdermin、IL-18、IL-1β的前体，从而触发细胞焦亡^［29-30］。Nef作为一种抗氧化剂，能够直接与ROS反应并清除ROS，抑制其生成与积累。YIN等^［26］研究表明，Nef可显著降低神经退行性疾病模型大鼠脑组织中的ROS水平。本研究动物及细胞实验进一步证实，Nef能抑制ROS/NLRP3/Caspase-1信号通路。以上结果表明，Nef在神经退行性疾病中可能通过清除ROS，发挥抗氧化及抗炎作用。因此，Nef可能通过抑制ROS的生成，干扰下游NLRP3炎性小体组装及Caspase-1前体的切割，从而抑制小胶质细胞焦亡。

本研究基于动物及细胞模型，揭示了Nef在PD中的神经保护潜力，但尚未深入探讨Nef调控ROS生成的具体机制，为当前研究的局限性。有证据表明，线粒体ROS与NAPDH氧化酶的相互作用可导致ROS升高，而Nef预处理能预防线粒体功能障碍，并抑制NADPH氧化酶表达^［31］，这一研究提示Nef的抗氧化机制与线粒体功能障碍相关，因此，后续研究可重点探究Nef是否通过调节线粒体功能进而抑制ROS的生成与积累，从而为Nef治疗PD提供充分的理论依据。

综上所述，本研究证明Nef可能通过ROS/NLRPS/Caspase-1通路抑制小胶质细胞焦亡，进而缓解PD相关的神经炎症和组织损伤。该发现为阐释Nef在PD治疗中的潜在作用机制提供了理论支持，并为其进一步临床应用奠定了基础。

参考文献

收起

文献

收起

参考文献引证文献

排序方式：

HARIZ

，BLOMSTEDT

. Deep brain stimulation for Parkinson’s disease［J］. J Intern Med，2022，292（5）：764-778.

https://doi.org/10.1111/joim.13541

COSTA

H N

，ESTEVES

A R

，EMPADINHAS

，et al. Parkinson’s disease：a multisystem disorder［J］. Neurosci Bull，2023，39（1）：113-124.

https://doi.org/10.1007/s12264-022-00934-6

MIRZAEI

，SEDIGHI

，KOUCHAKI

，et al. Probiotics and the treatment of Parkinson’s disease：an update［J］. Cell Mol Neurobiol，2022，42（8）：2449-2457.

https://doi.org/10.1007/s10571-021-01128-w

WEINTRAUB

，AARSLAND

，CHAUDHURI

K R

，et al. The neuropsychiatry of Parkinson’s disease：advances and challenges［J］. Lancet Neurol，2022，21（1）：89-102.

https://doi.org/10.1016/s1474-4422（21）00330-6

Z J

，PAN

，TANG

S H

，et al. Global trends in the incidence，prevalence，and years lived with disability of Parkinson’s disease in 204 countries/territories from 1990 to 2019［J］. Front Public Health，2021，9：776847.

https://doi.org/10.3389/fpubh.2021.776847

T T

，GAO

，LI

P L

，et al. Pyroptosis，metabolism，and tumor immune microenvironment［J］. Clin & Translat Med，2021，11（8）：e492.

https://doi.org/10.1002/ctm2.492

ELIAS

E E

，LYONS

，MURUVE

D A

. Gasdermins and pyroptosis in the kidney［J］. Nat Rev Nephrol，2023，19（5）：337-350.

https://doi.org/10.1038/s41581-022-00662-0

YIN

，YIN

Z Y

，LAI

，et al. Pyroptosis in periprosthetic osteolysis［J］. Biomolecules，2022，12（12）：1733.

https://doi.org/10.3390/biom12121733

NIU

，CHEN

L J

，LI

，et al. Ferroptosis，necroptosis，and pyroptosis in the tumor microenvironment：perspectives for immunotherapy of SCLC［J］. Semin Cancer Biol，2022，86：273-285.

https://doi.org/10.1016/j.semcancer.2022.03.009

BERTHELOOT

，LATZ

，FRANKLIN

B S

. Necroptosis，pyroptosis and apoptosis：an intricate game of cell death［J］. Cell Mol Immunol，2021，18（5）：1106-1121.

https://doi.org/10.1038/s41423-020-00630-3

，ZHANG

，LIU

，et al. Pyroptosis：mechanisms and diseases［J］. Sig Transduct Target Ther，2021，6：128.

https://doi.org/10.1038/s41392-021-00507-5

窦赫，马爽，邾月，等. 细胞焦亡的生物学机制及其在乳腺癌中的研究进展［J］. 肿瘤防治研究，2022，49（11）：1175-1179.

https://doi.org/10.3971/j.issn.1000-8578.2022.22.0485

DOU

，MA

，ZHU

，et al. Biological mechanism of pyroptosis and its research progress in breast cancer［J］. Cancer Res Prev Treat，2022，49（11）：1175-1179.

https://doi.org/10.3971/j.issn.1000-8578.2022.22.0485

KENT

S A

，MIRON

V E

. Microglia regulation of central nervous system myelin health and regeneration［J］. Nat Rev Immunol，2024，24（1）：49-63.

https://doi.org/10.1038/s41577-023-00907-4

ZHENG

Y Q

，GRAEBER

M B

. Microglia and brain macrophages as drivers of glioma progression［J］. Int J Mol Sci，2022，23（24）：15612.

https://doi.org/10.3390/ijms232415612

PENG

，HU

G Q

，YAO

Q F

，et al. Microglia autophagy in ischemic stroke：a double-edged sword［J］. Front Immunol，2022，13：1013311.

https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.1013311

刘玥滢，杜天舒，刘玚，等. 小胶质细胞介导的吞噬作用在神经退行性疾病中的研究进展［J］. 生理学报，2022，74（2）：283-293.

https://doi.org/10.13294/j.aps.2022.0031

LIU

Y Y

，DU

T S

，LIU

，et al. Phagocytosis of microglia in neurodegenerative diseases［J］. Acta Physiol Sin，2022，74（2）：283-293.

https://doi.org/10.13294/j.aps.2022.0031

JIANG

Z Y

，YIN

，WANG

，et al. β-Hydroxybutyrate alleviates pyroptosis in MPP+/MPTP-induced Parkinson’s disease models via inhibiting STAT3/NLRP3/GSDMD pathway［J］. Int Immunopharmacol，2022，113：109451.

https://doi.org/10.1016/j.intimp.2022.109451

KOU

，CHI

X S

，SUN

Y D

，et al. The circadian clock protein Rev-erbα provides neuroprotection and attenuates neuroinflammation against Parkinson’s disease via the microglial NLRP3 inflammasome［J］. J Neuroinflammation，2022，19（1）：133.

https://doi.org/10.1186/s12974-022-02494-y

ZHENG

，RUAN

，YAN

Y Q

，et al. Melatonin attenuates neuroinflammation by down-regulating NLRP3 inflammasome via a SIRT1-dependent pathway in MPTP-induced models of Parkinson’s disease［J］. J Inflamm Res，2021，14：3063-3075.

https://doi.org/10.2147/jir.s317672

ZHOU

Y F

，ZHANG

Y T

，WANG

H W

，et al. Microglial pyroptosis in hippocampus mediates sevolfurane-induced cognitive impairment in aged mice via ROS-NLRP3 inflammasome pathway［J］. Int Immunopharmacol，2023，116：109725.

https://doi.org/10.1016/j.intimp.2023.109725

BHARATHI PRIYA

，HUANG

C Y

，HU

R M

，et al. An updated review on pharmacological properties of neferine：a bisbenzylisoquinoline alkaloid from Nelumbo nucifera［J］. J Food Biochem，2021，45（12）：e13986.

https://doi.org/10.1111/jfbc.13986

AMSSAYEF

，EDDOUKS

. Alkaloids as vasodilator agents：a review［J］. Curr Pharm Des，2023，29（24）：1886-1895.

https://doi.org/10.2174/1381612829666230809094313

WANG

ming-yue

，ZHANG

S S

，AN

meng-fei

，et al. Neferine ameliorates nonalcoholic steatohepatitis through regulating AMPK pathway［J］. Phytomedicine，2023，114：154798.

https://doi.org/10.1016/j.phymed.2023.154798

TANG

，ZENG

，SONG

L L

，et al. Extracellular vesicle delivery of neferine for the attenuation of neurodegenerative disease proteins and motor deficit in an Alzheimer’s disease mouse model［J］. Pharmaceuticals，2022，15（1）：83.

https://doi.org/10.3390/ph15010083

TANG

Y S

，ZHAO

Y H

，ZHONG

，et al. Neferine inhibits LPS-ATP-induced endothelial cell pyroptosis via regulation of ROS/NLRP3/Caspase-1 signaling pathway［J］. Inflamm Res，2019，68（9）：727-738.

https://doi.org/10.1007/s00011-019-01256-6

YIN

S Z

，RAN

，YANG

，et al. Nootropic effect of neferine on aluminium chloride-induced Alzheimer’s disease in experimental models［J］. J Biochem Mol Toxicol，2020，34（2）：e22429.

https://doi.org/10.1002/jbt.22429

LIN

T Y

，HUNG

C Y

，CHIU

K M

，et al. Neferine，an alkaloid from Lotus Seed embryos，exerts antiseizure and neuroprotective effects in a kainic acid-induced seizure model in rats［J］. Int J Mol Sci，2022，23（8）：4130.

https://doi.org/10.3390/ijms23084130

，WAN

，GAO

X Y

，et al. Microglia pyroptosis：a candidate target for neurological diseases treatment［J］. Front Neurosci，2022，16：922331.

https://doi.org/10.3389/fnins.2022.922331

ZHENG

D D

，LIU

，PIAO

H L

，et al. ROS-triggered endothelial cell death mechanisms：focus on pyroptosis，parthanatos，and ferroptosis［J］. Front Immunol，2022，13：1039241.

https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.1039241

WANG

F H

，LIANG

Q Q

，MA

Y X

，et al. Silica nanoparticles induce pyroptosis and cardiac hypertrophy via ROS/NLRP3/Caspase-1 pathway［J］. Free Radic Biol Med，2022，182：171-181.

https://doi.org/10.1016/j.freeradbiomed. 2022.02.027

PRIYA

L B

，BASKARAN

，HUANG

C Y

，et al. Neferine ameliorates cardiomyoblast apoptosis induced by doxorubicin：possible role in modulating NADPH oxidase/ROS-mediated NFκB redox signaling cascade［J］. Sci Rep，2017，7：12283.

https://doi.org/10.1038/s41598-017-12060-9.yi

2025年第47卷第23期

PDF下载

引用本文

BibTeX

文章信息

doi: 10.16016/j.2097-0927.202509003

接收时间：2025-09-01
首发时间：2026-10-30
出版时间：2025-12-15

补充材料

相关文章

文章信息

作者

出版历史

收稿日期：2025-09-01
修回日期：2025-11-17

基金

作者信息

¹贵州中医药大学研究生院，贵州贵阳

²清镇市第一人民医院重症医学科，贵州贵阳

³遵义医科大学研究生院，贵州遵义

⁴贵州省人民医院全科医学科，贵州贵阳

通讯作者:

田锦勇，E-mail：tjy8877@163.com

TIAN Jinyong，E-mail：tjy8877@163.com

参考文献

分享链接

https://castjournals.cast.org.cn/joweb/ljjydxxb/CN/10.16016/j.2097-0927.202509003

分享至

全文二维码

扫描看全文

引用本文

BibTeX

本文的引用情况

2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

关闭全屏

BibTeX
EndNote
RefWorks
TxT