科学技术与工程

前项	后项	支持度/%	置信度/%	提升度	频次
黄芩,白术,栀子	→茵陈	72.06	97.56	1.03	49
大黄,黄芩,白术	→茵陈	57.35	100	1.03	39
甘草,黄芩,白术	→茵陈	55.88	100	1.03	38
大黄,黄芩,白术,栀子	→茵陈	44.12	100	1.03	30
茯苓,黄芩,白术,栀子	→茵陈	44.12	100	1.03	30
甘草,黄芩,白术,栀子	→茵陈	42.65	100	1.03	29

前项	后项	支持度/%	置信度/%	提升度	频次
黄芩,白术,栀子	→茵陈	72.06	97.56	1.03	49
大黄,黄芩,白术	→茵陈	57.35	100	1.03	39
甘草,黄芩,白术	→茵陈	55.88	100	1.03	38
大黄,黄芩,白术,栀子	→茵陈	44.12	100	1.03	30
茯苓,黄芩,白术,栀子	→茵陈	44.12	100	1.03	30
甘草,黄芩,白术,栀子	→茵陈	42.65	100	1.03	29

API浓度/(μmol·L^-1)	细胞活性/%
0	100.00±0.08
5	100.57±8.88
10	115.84±11.09^*
20	136.41±4.50^**
40	105.02±8.30
80	87.57±3.97^*

API浓度/(μmol·L^-1)	细胞活性/%
0	100.00±0.08
5	100.57±8.88
10	115.84±11.09^*
20	136.41±4.50^**
40	105.02±8.30
80	87.57±3.97^*

组别	浓度/(μmol·L^-1)	细胞活性/%
NC组	—	100.00±0.03
TCA组	100	58.07±3.28^**
10-API组	10	64.69±1.50^#
20-API组	20	75.76±2.08^##

组别	浓度/(μmol·L^-1)	细胞活性/%
NC组	—	100.00±0.03
TCA组	100	58.07±3.28^**
10-API组	10	64.69±1.50^#
20-API组	20	75.76±2.08^##

组别	浓度/(μmol·L^-1)	细胞凋亡率/%
NC组	—	7.33±1.52
TCA组	100	22.58±1.87^**
20-API组	20	12.33±3.55^##
LY294002组	5	25.61±2.92
LY294002+20-API组	5+20	20.72±2.33^▲

组别	浓度/(μmol·L^-1)	细胞凋亡率/%
NC组	—	7.33±1.52
TCA组	100	22.58±1.87^**
20-API组	20	12.33±3.55^##
LY294002组	5	25.61±2.92
LY294002+20-API组	5+20	20.72±2.33^▲

组别	浓度/(μmol·L^-1)	p-PI3K/ PI3K	p-AKT/AKT	Bax/Bcl-2
NC组	—	1.24±0.03	0.49±0.03	0.20±0.01
TCA组	100	1.11±0.02^*	0.40±0.01^*	2.76±0.16^**
20-API组	20	1.91±0.07^##	0.61±0.06^##	0.62±0.02^##
LY294002组	5	0.49±0.13^##	0.38±0.12	1.78±0.05^#
LY294002+20-API组	5+20	1.25±0.01^▲▲	0.55±0.07^▲	1.09±0.08^▲▲

组别	浓度/(μmol·L^-1)	p-PI3K/ PI3K	p-AKT/AKT	Bax/Bcl-2
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LY294002+20-API组	5+20	1.25±0.01^▲▲	0.55±0.07^▲	1.09±0.08^▲▲

含芩术方剂治疗妊娠期肝内胆汁淤积症的药-方-效关联研究

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吴斌 , 吴忠 , 魏秀岩 ^*

科学技术与工程 | 论文·医药、卫生 2025,25(18): 7538-7550

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科学技术与工程 | 论文·医药、卫生 2025, 25(18): 7538-7550

含芩术方剂治疗妊娠期肝内胆汁淤积症的药-方-效关联研究

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吴斌, 吴忠, 魏秀岩^*

作者信息

沈阳药科大学生命科学与生物制药学院, 沈阳 110016

吴斌(1994—),男,汉族,辽宁沈阳人,硕士研究生。研究方向:肝病中药药效学和机制。E-mail:1737826609@qq.com。

通讯作者:

^* 魏秀岩(1975—),女,汉族,辽宁沈阳人,博士,副教授。研究方向:中药药效学和机制。E-mail:wei_xiuyan@163.com。

The Herb-Prescription-Effect Correlation of Prescriptions Containing Scutellariae radix and Atractylodis macrocephalae Rhizoma in the Treatment of Intrahepatic Cholestasis of Pregnancy

Bin WU, Zhong WU, Xiu-yan WEI^*

Affiliations

School of Life Science and Biopharmaceutics, Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110016, China

出版时间: 2025-06-28 doi: 10.12404/j.issn.1671-1815.2405545

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摘要

收起

探析了含黄芩-白术药对方剂治疗妊娠期肝内胆汁淤积症(intrahepatic cholestasis of pregnancy, ICP)的应用规律及作用机制。检索维普, 万方, 中国知网数据库中含黄芩-白术药对方剂治疗ICP的文献,利用R语言对方剂进行分析并归纳其用药规律及核心方;再运用网络药理学预测核心方抗ICP的作用机制,并进行分子对接和实验验证。共纳入68首方剂,包含67味中药,多为寒性、苦味、归脾经的药物。综合中药数据分析获得“茵陈-大黄-栀子-黄芩-白术-茯苓”为核心方,其中槲皮素、芹菜素等关键活性成分可能作用于蛋白激酶B1(serine/threonine kinase B1, AKT1)、BCL-2相关X蛋白(BCL-2 associated X protein, BAX)等核心靶点,参与磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B (phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B, PI3K-AKT)、凋亡等多靶点、多通路发挥治疗ICP作用。在分子对接中,芹菜素与11个核心靶点间的结合效能显著优于槲皮素、β-谷甾醇。HTR-8/SVneo细胞实验表明,芹菜素对牛磺胆酸(taurocholic acid,TCA)诱导的细胞凋亡率、Bax/Bcl-2蛋白表达增加具有显著抑制作用(P<0.01),并可促进p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白的表达(P<0.01),而LY294002预处理可逆转芹菜素的抗凋亡作用和上述蛋白的表达水平。综上,含黄芩-白术药对的核心方可为ICP的临床遣方用药提供参考,其中关键活性成分芹菜素可抑制TCA诱导HTR-8/SVneo细胞凋亡而具有治疗ICP的潜力,其机制可能与调控PI3K-AKT信号通路相关。

关键词

妊娠期肝内胆汁淤积症 / 黄芩-白术 / 细胞凋亡 / PI3K-AKT信号通路

Abstract

收起

To explore the application regularity and mechanism of formulas containing Huang Qin (Scutellariae radix)-Bai Zhu (Atractylodis macrocephalae Rhizoma) (HQ-BZ) herb pair in the treatment of ICP (intrahepatic cholestasis of pregnancy). All literature on prescriptions containing HQ-BZ herb pairs against ICP was screened from the VIP, Wanfang, and CNKI databases. Subsequently, the R language was employed to analyze and summarize its medication rules and core prescriptions. Network pharmacology was used to predict the mechanism of core prescriptions against ICP, followed by molecular docking and experimental verification to confirm the potential mechanism. A total of 68 prescriptions were included, involving 67 herbs characterized mainly by cold, bitter, and spleen meridian. The core prescription “Artemisiae scopariae Herba-Rhei radix et Rhizoma-Gardeniae fructus-Scutellariae radix-Atractylodis macrocephalae Rhizoma-Poriacocos” was obtained based on the comprehensive analysis of traditional Chinese medicine data, among which quercetin, apigenin, and other key active components may act on core targets such as AKT1 (serine/threonine kinase B1), BAX (BCL2-associated X protein), and participate in PI3K-AKT (phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B), apoptosis, and other multiple targets and pathways to play the role of ICP therapy. The molecular docking results showed that apigenin demonstrated superior binding affinity with the top 11 core targets compared to quercetin and beta-sitosterol. HTR-8/SVneo cell experiments proved that apigenin significantly reduced the apoptosis rate induced by TCA (taurocholic acid) and elevated the protein expression levels of Bax/Bcl-2 (P<0.01), as well as p-PI3K/PI3K, and p-AKT/AKT (P<0.01). Pre-treatment with LY294002 could reverse the anti-apoptosis effects and the expression levels of the aforementioned proteins induced by apigenin. In summary, the core prescription that includes the HQ-BZ can provide references for the clinical prescription of ICP. Apigenin, a key component of core prescription, can inhibit the apoptosis in HTR-8/SVneo cells induced by TCA and has the potential to treat ICP, and its mechanism may be related to the regulation of the PI3K-AKT signaling pathway.

Key words

intrahepatic cholestasis of pregnancy / Scutellariae radix-Atractylodis macrocephalae Rhizoma / cell apoptosis / PI3K-AKT signaling pathway

引用本文

吴斌, 吴忠, 魏秀岩. 含芩术方剂治疗妊娠期肝内胆汁淤积症的药-方-效关联研究. 科学技术与工程, 2025 , 25 (18) : 7538 -7550 . DOI: 10.12404/j.issn.1671-1815.2405545

Bin WU, Zhong WU, Xiu-yan WEI. The Herb-Prescription-Effect Correlation of Prescriptions Containing Scutellariae radix and Atractylodis macrocephalae Rhizoma in the Treatment of Intrahepatic Cholestasis of Pregnancy[J]. Science Technology and Engineering, 2025 , 25 (18) : 7538 -7550 . DOI: 10.12404/j.issn.1671-1815.2405545

正文

收起

妊娠期肝内胆汁淤积症(intrahepatic cholest-asis of pregnancy, ICP)是孕中晚期常见的特异性肝病,在人群中的发病率为0.3%~15%,并以母体瘙痒、黄疸、肝功能损伤及高胆汁酸水平为主特征^[1]。ICP是围产期并发症及母婴死亡的主要诱因,其中早产、窒息事件、死产等妊娠不良结局的风险增加与ICP胆汁酸水平持续升高相关^[2],并且ICP母体高胆汁酸代谢异常还可引起胎盘绒毛膜滋养细胞的凋亡、侵袭等功能异常,继而引起胎盘生理功能重构,但具体机制尚待深入探究^[3]。此外,ICP的发生与进展还被认为与滋养细胞的氧化应激、细胞凋亡、胎盘微环境及免疫失衡等生物学过程有关,并涉及多个潜在靶点或信号通路的调控^[4]。然而,目前以单一靶标为主的基础药物(如熊去氧胆酸、多烯磷脂酰胆碱等)难以应对ICP繁杂的发病机制^[5],而中医药的一方多药、一药多效特性对ICP的多器官损伤具有潜在的预防和治疗价值。因此,临床亟待确有疗效的治疗方药或多靶点的活性成分以缓解这种治疗窘境。

“黄芩-白术”药对始于《丹溪心法·金匮当归散论》所著的“安胎圣药”,多见于当归散、四圣散、安胎饮等临床经典方剂^[6],并对妊娠期高血压^[7]、妊娠期糖尿病^[8]和复发性流产^[9]等妇产科疾病的治疗作用显著。多项研究表明,含此药对的方剂对改善ICP临床体征、减少妊娠不良结局、抑制滋养细胞凋亡及修复胆汁酸稳态等方面具有显著的损伤保护作用^[10-11]。另外,中药组方涉及两种中药的应用,是中药复方中相对固定的最小处方单位,在中药药性配伍及七情和合实践中具有重要的参考价值^[12]。其中,药对不仅仅是对单味药功效的深层升华,更是中药与新方剂配伍的衔接桥梁。以药对为“基药”,既可探究其在确有疗效方剂中的配伍规律,又可为治疗ICP的新方挖掘和作用机制探究奠定基础^[13]。

因此,现以中药、活性化合物、靶标的复杂关系研究为切入点,基于R语言数据挖掘技术、网络药理学和细胞实验等方法,探究含黄芩-白术药对的方剂治疗ICP的核心方及其作用机制,以期为临床诊疗和新药探索提供参考。

1 材料

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1.1 细胞株

人绒毛膜滋养层细胞(HTR-8/SVneo细胞)购自EK-Bioscience公司。

1.2 主要试剂和仪器

芹菜素(纯度≥98%)、PI3K抑制剂LY294002、牛磺胆酸钠(货号分别为S31423、S43088、S26985,上海源叶生物科技有限公司);BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(货号分别为XY91070、XY96010,上海信裕生物科技有限公司);CCK-8试剂盒(货号CA1210,北京索莱宝科技有限公司);Annexin V-FITC/PI试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒、BAX抗体、BCL-2抗体(货号分别为C1062S、P0018S、AB026、AB112,上海碧云天生物技术有限公司); PI3K抗体、p-PI3K抗体、AKT抗体、p-AKT抗体(货号分别为R22768、341468、R23412、R22961,成都正能生物技术有限责任公司);GAPDH抗体(货号60004-1-Ig,武汉三鹰生物技术有限公司)。

二氧化碳培养箱(HF90型,上海力申科学仪器有限公司);生物安全柜(HFsafe-1500LC型,力新仪器(上海)有限公司);电泳、电转系统(DYCZ-24DN型,北京六一仪器厂);低温高速离心机(TGL-16型,长沙湘仪离心机仪器有限公司);流式细胞仪(CytoFLEX型,Beckman公司)。

2 方法

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2.1 方剂来源和筛选

以“黄芩-白术”和“妊娠期肝内胆汁淤积症”为检索词,设定20100101-20220701为检索周期,组合检索维普(VIP)、万方(Wanfang)、中国知网(CNKI)数据库中的文献资料。文献纳入标准:① 符合ICP诊断的随机化临床试验类型文献;② 研究以含黄芪-白术药对的中药或中药联合常规西药治疗为干预措施;③ 研究组的主要结局指标与对照组相比具有统计学意义。文献排除标准:① 患者合并除ICP的其他疾病;② 中医方药味数≤3味或非口服用药;③ 文献所载处方中药信息缺失;④ 研究为动物实验、数据挖掘、综述等类型。

2.2 方剂数据库建立

利用MedRef(V5.0)软件对数据库中检索的文献进行查重和预处理,参考文献[14]对中药进行标准化处置,如将“绵茵陈”规范为“茵陈”、将“制军”规范为“大黄”后建立ICP数据库。经初步筛选获得275篇相关文献,在符合纳入、排除标准以及人工筛选的基础上,最终确定了68篇文献的方剂建立ICP数据库。

2.3 中药方剂分析

利用R Studio(V4.1.3)软件对方剂进行频次统计,并基于arules包中Apriori算法建立关联规则模型,设定支持度≥40%,置信度≥80%,提升度>1进行关联规则分析及可视化。对四气、五味、归经统计运用中医传承计算平台(V3.0)软件的统计分析模块进行分析,并基于肘部法K-means算法对高频中药进行潜在方剂挖掘和聚类分析。

2.4 核心方活性化合物与ICP靶点筛选

基于中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)数据库(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)和UniProt数据库(https://www.uniprot.org/),设定口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和类药性(drug likeness,DL)≥0.18为标准筛选茵陈、大黄、栀子、黄芩、白术、茯苓的活性成分,并结合文献补充活性成分后对中药靶点名称进行标准化处置^[15]。以intrahepatic cholestasis of pregnancy为检索词,对GeneCards(https://www.genecards.org/)数据库进行检索获取ICP相关靶点。

2.5 核心方治疗ICP的活性成分及靶点分析

利用Venny V2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)获取核心方活性成分潜在靶点与ICP相关靶点的交集靶点,并构建“中药-活性成分-交集靶点”可视化图。基于String(V11.5)数据库(https://cn.string-db.org/),分别设定置信度>0.900、Organism为Homo sapiens获取交集靶点蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction, PPI)网络。再以Cytoscape(V3.10.1)软件CytoHubba插件中最大团中心性(maximal clique centrality,MCC)、最大邻域分量(maximum neighborhood component,MNC)、度中心性(degree centrality,Degree)、边缘渗透分量(edge percolated component,EPC)、介数中心性(betweenness centrality,Betweenness)、紧密中心性(closeness centrality,Closeness)算法筛选排名前30位基因,并取交集获得核心靶点。

2.6 核心方治疗ICP的靶点富集分析

使用Sangerbox(V3.0)平台(http://vip.sangerbox.com/)对核心靶点的潜在机制进行京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)和基因本体(gene ontology, GO)富集分析,并对KEGG(前15位)和GO(前10位)条目进行可视化。

2.7 分子对接

选取2.5节的核心靶点与Degree值排名前三的关键活性成分进行分子对接验证。检索PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)和PDB(https://www.rcsb.org/)数据库分别获得活性成分和靶点的3D结构,使用AutoDock Tools(V1.5.7)软件进行去水、加氢等对接验证和结合能计算,并以结合能<-5 kcal/mol进行结合活性筛选后^[16],运用PyMOL软件对结果进行可视化。

2.8 芹菜素对HTR-8/SVneo细胞活性的影响

在2.5节的PPI Network 中Degree值前三的关键活性成分为槲皮素(Degree=184)、β-谷甾醇(Degree=52)、芹菜素(Degree=44),但与槲皮素、β-谷甾醇等活性成分相比,芹菜素对滋养细胞更具低毒、无诱变性等特性^[17],且与核心靶点的结合能活性更优,因此选择芹菜素作进一步的机制验证研究。

取置于37 ℃、5% CO₂、RPMI 1640培养基中稳定传代后对数生长期的 HTR-8/SVneo 细胞,以1×10⁴ 个/孔接种于96 孔板,设置空白组(RPMI 1640 完全培养基)、对照组(含0.1% DMSO 的RPMI 1640 完全培养基培养细胞)、芹菜素组(5、10、20、40、80 μmol/L)。24 h后加入10% CCK-8溶液继续孵育细胞2 h,酶标仪测定450 nm波长下的吸光度。

2.9 芹菜素对TCA诱导后HTR-8/SVneo细胞活性的影响

采用100 μmol/L TCA作用于HTR-8/SVneo细胞24 h,建立ICP细胞模型^[18]。实验设置正常对照组(NC)、模型组(TCA)、芹菜素组(API)。TCA组:HTR-8/SVneo细胞与100 μmol/L TCA干预24 h;API组:HTR-8/SVneo细胞造模后,加入API(10、20 μmol/L)干预24 h;NC组加入等量不含TCA的完全培养基。按“2.8”项下CCK-8法测定细胞活性。

2.10 芹菜素对TCA诱导后HTR-8/SVneo细胞凋亡的影响

按2.9节下分为NC组、TCA组、API组(20 μmol/L)、LY294002 组(5 μmol/L^[19])及LY294002+API组处置细胞,PBS润洗2次,加入缓冲液重悬细胞。5 μL Annexin V-FITC/PI试剂在室温下避光孵育15 min,流式细胞仪加样进行凋亡率测定。

2.11 蛋白免疫印迹法(Western blot)法检测p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、Bax/Bcl-2表达

HTR-8/SVneo细胞按2.10节下分组处置后,使用含2%蛋白酶抑制剂RIPA裂解液提取总蛋白,以BCA法测定蛋白浓度;经SDS-PAGE凝胶电泳、PVDF转膜、封闭后,与稀释的一抗PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、Bcl-2、Bax,4 ℃ 孵育过夜;室温孵育二抗90 min,滴加ECL发光液进行曝光显影。以GAPDH为内参,采用Image J(V1.48)软件进行灰度值分析。

2.12 统计分析

数据以均值±标准差($\bar{x} \pm s$)表示,采用Graphpad Prism(V 9.4.1)软件进行数据统计分析,多组间以One-way ANOVA计算P值,P<0.05 为差异具有统计学意义。

3 结果与分析

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3.1 中药频次和四气、五味、归经统计

对符合入排标准的68首方剂进行频次统计,包含67味中药,使用频次共701次。19味高频中药(频次≥10次)中频次前6位的分别为黄芩(68次)、白术(68次)、茵陈(66次)、栀子(49次)、茯苓(44次)、大黄(39次);四气以寒性为主(387次),次为温性(161次);五味以苦味(447次)最多见,次为甘味(329次);归经以脾经(465次)、肝经(282次)居多,如图1所示。

3.2 中药关联规则和聚类分析

基于Apriori算法建模对高频中药进行关联规则分析获取6条药物组合(表1),R软件绘制高频中药网络可视图(图2)。由图表可见,各组合Lift均>1,其中茵陈、大黄、栀子、茯苓、甘草与黄芩-白术药对组成核心关联药物。

对19味高频中药基于factoextra包中K均值聚类算法(K-means clustering algorithm)进行聚类分析,并结合肘部法确定K-means最佳K值。由此可知,拐点为4时可获取最佳聚类个数,即类似于形成4个核心类方,并利用fviz_nbclust函数对基于划分的聚类结果进行可视化(图3)。

3.3 核心方活性成分与ICP靶点筛选

综合中药频次、关联规则和聚类分析3个维度,最终获得HQ-BZ治疗ICP的核心方为茵陈-大黄-栀子-黄芩-白术-茯苓。依据设定的OB和DL值检索TCMSP数据库和文献共获得核心方87种候选活性成分(含重复成分),其中茵陈(YC)13种,大黄(DH)14种,栀子(ZZ)13种,黄芩(HQ)36种,白术(BZ)4种,茯苓(FL)7种(图4)。经UniProt数据库标准化处理后,去除重复或无靶点的活性成分,最终获得81种活性成分和258个靶点,经GeneCards数据库检索后获取1 326个ICP相关靶点。

3.4 核心方治疗ICP的活性成分及靶点分析

利用Venny获得123个核心方治疗ICP的交集靶点,Cytoscape软件构建“中药-活性成分-交集靶点”可视化图(图5)。根据Degree值可知,核心方中槲皮素(A)、β-谷甾醇(B)、芹菜素(HQ1)等可能是ICP治疗的关键活性成分。利用String数据库获得由123个节点和436个边构建的交集靶点PPI网络,经CytoHubba插件的6种算法分析获得11个核心靶点,其分别为:蛋白激酶B1(AKT1)、丝裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma 2,BCL-2)、半胱天冬酶3(caspase 3,CASP3)、肿瘤蛋白p53(tumor protein p53,TP53)、白细胞介素6(interleukin 6,IL6)、雌激素受体1(estrogen receptor 1,ESR1)、Jun原癌基因(Jun proto-oncogene,JUN)、BCL-2相关X蛋白(BAX)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1,CCND1)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF),如图6所示。

3.5 核心方治疗ICP的靶点富集分析

基于Sangerbox平台设定错误发现率(false discovery rate,FDR)< 0.05和P < 0.05对核心靶点进行GO和KEGG富集分析,并按基因数进行排序展示。GO数据库包括生物过程(biology process,BP)、细胞成分(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)等重要部分。其中BP主要涉及氧化应激、细胞外刺激、凋亡等过程;CC主要包括膜筏、线粒体外膜等成分;MF主要包括DNA结合转录因子、蛋白酶、磷酸酶结合等功能(图7)。根据KEGG分析揭示,凋亡、PI3K-AKT信号通路等多种潜在通路可能为核心方抗ICP的关键调控途径,如图8所示。

3.6 分子对接

核心方中3个关键活性成分槲皮素(quercetin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、芹菜素(apigenin)与11个核心靶点的结合能均<-5 kcal/mol,如图9所示。结果表明,核心方活性成分与核心靶点具有优良结合能力而发挥抗ICP的作用。此外,对结合能最低的前4个对接结果进行可视化,如图10所示。

3.7 芹菜素对HTR-8/SVneo细胞活性的影响

如表2所示,与0 μmol/L API 比较,HTR-8/SVneo细胞经浓度≥40 μmol/L API处理后细胞增殖产生降低趋势,且API(≥80 μmol/L)时可显著抑制细胞活性(P<0.05);当API(5~20 μmol/L)对HTR-8/SVneo细胞活性具有促增殖作用,但API浓度为10、20 μmol/L时具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。故后续实验选择(10、20 μmol/L)API进行相关研究。

3.8 芹菜素对TCA诱导HTR-8/SVneo细胞活性的影响

如表3所示,与NC组比较,TCA组细胞活性显著降低(P<0.01);与TCA组比较,API可显著改善HTR-8/SVneo细胞活性,并在20 μmol/L时发挥最佳保护效应(P<0.01)。故选定20 μmol/L API为后续实验研究剂量。

3.9 芹菜素对TCA诱导后HTR-8/SVneo细胞凋亡的影响

如图11和表4所示,TCA损伤HTR-8/SVneo细胞后凋亡率显著高于NC组(P<0.01),经API干预后细胞凋亡率减少(P<0.01),但加入LY294002后,API的抗凋亡作用被逆转(P<0.05)。

3.10 芹菜素对HTR-8/SVneo细胞PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、Bcl-2、Bax表达的影响

如图12和表5所示,与NC组相较,TCA组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达减少(P<0.05),Bax/Bcl-2蛋白表达显著增加(P<0.01);与TCA组相较,API组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达显著增加(P<0.01),Bax/Bcl-2蛋白表达显著降低(P<0.01),LY294002组p-PI3K/PI3K、Bax/Bcl-2蛋白表达减少(P<0.01,P<0.05),p-AKT/AKT蛋白表达减少但无统计学意义(P>0.05);而LY294002处理后,API对p-PI3K/PI3K、Bax/Bcl-2、p-AKT/AKT的蛋白表达水平被逆转(P<0.01,P<0.05)。

4 讨论

收起

ICP是一种主要由高胆汁酸所引起滋养细胞功能失调的妊娠期并发症,可显著增加肝胆疾病、不良围产期结局等风险,并对女性身心健康和国家“三孩生育政策”的实施产生重要影响^[20]。研究表明^[21],中药(包括其活性成分)在ICP治疗中具有安全、经济、副作用少的独特优势,其中黄芩-白术药对具有清热燥湿、健脾益气、安胎等功效,常作为中医药治疗ICP的经典高频药对。然而,迄今对含黄芩-白术药对治疗ICP的方药规律和作用机制的研究较少。因此,本文研究纳入68篇含“黄芩-白术”药对治疗ICP的临床试验类文献资料进行方药规律和核心方的R语言数据挖掘,并引入网络药理学、分子对接和体外实验相结合的交叉研究方法,便于将经验传承和产品转化付诸于真实世界的临床实践环境。

对68首ICP方剂进行数据挖掘分析表明,清热类(茵陈、黄芩、栀子)、利水渗湿类(茯苓、泽泻)、补虚类(白术、甘草)等药物频次较高,并以归脾经、肝经、寒性、苦味的中药为主。ICP病机之关键为湿热,在妊娠期间,由于产妇过多食用滋补油腻之品或少有活动,机体脾胃运化失常而多湿热内蕴,故应用清热、渗湿、补虚,归脾经的药物治疗ICP可谓药证相符。进一步基于Apriori算法探究中药治疗ICP的药物组合,其中茵陈、栀子、大黄、茯苓与黄芩-白术药对构成了治疗ICP的核心组方药物。此配伍可视作黄疸名方“茵陈蒿汤”和“安胎圣药”的加减方。既往研究也表明^[22],茵陈具有清解湿热、保肝利胆、抗氧化及抑制炎症应激的效用,并可有效维持机体中1型T辅助细胞(T helper cell 1,Th1/)/Th2的平衡,从而增强母胎免疫耐受,显著减少死胎、流产的风险;栀子提取物通过参与多种胆汁酸转运体和肝-肠-粪便途径,对胆汁淤积性肝损伤发挥保护作用^[23];大黄可调控核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)信号通路,改善氧化应激损伤和胆汁酸代谢而发挥抗胆汁淤积作用^[24];茯苓中的活性成分茯苓多糖,因其抗炎和抗氧化特性,对妊娠期肝损伤具有潜在的有益功效^[25]。另外,基于肘部法K-means算法获取4个潜在核心类方组合,其中分组4相对独立且更符合医家对ICP的诊疗学术思想。方中茵陈、栀子、大黄三者共奏清热祛湿、疏肝益气,合用黄芩-白术健脾安胎之疗效,与ICP治疗清热利湿为主,兼以补虚活血、益气健脾、安胎的基本治则相契合^[26]。因此,基于频数统计、Apriori算法、K-means算法最终确定茵陈-大黄-栀子-黄芩-白术-茯苓为治疗ICP的核心方,其作用机制和理法方药值得进一步深入探究。

对核心方中药进行网络药理学研究表明,方中槲皮素、β-谷甾醇、芹菜素等活性成分与大多数ICP靶点相互作用,并被确认为核心方的关键活性化合物。既往药理研究表明,槲皮素是一种结构类似雌激素的类黄酮化合物,可对雌激素发挥双向调节效用,并对法尼醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)信号通路相关蛋白表达激活而具有保肝利胆的功能,但因对滋养细胞的毒性而可能限制其临床应用^[27]。β-谷甾醇作为常见的植物甾醇,可促进产妇分泌Th1以维持正常妊娠免疫状态的Th1/Th2平衡,并可抑制氨基转移酶活性和炎症介质释放而减轻细胞凋亡^[28-29]。研究表明^[30],芹菜素可对滋养细胞凋亡、氧化应激及肝损伤等生物过程发挥显著保护作用。对生殖系统而言,芹菜素常作为黄芩、女贞子、益母草等保胎中药的有效活性成分,并在妊娠期糖尿病^[31]、子痫前期^[32]等HTR8-SVneo细胞模型研究中均显示出潜在的损伤保护效应,这进一步揭示了芹菜素在妊娠期疾病中的潜在治疗价值,但其是否对TCA诱导的ICP模型尚不明确。本文研究结果表明,芹菜素可改善TCA诱导HTR-8/SVneo细胞的活性,发挥对TCA致细胞损伤的保护效应,这与既往相关研究结果相似^[32]。另外,利用CytoHubba插件获取MAPK1、BCL2、AKT1、IL-6等11个核心靶点,这可能是ICP发生和进展的关键靶标。人类胎盘的发育完全依赖于滋养层细胞的正常分化、增殖和侵袭,而HTR-8/SVneo细胞的生理功能受损可导致严重的妊娠并发症。其中HTR-8/SVneo细胞经MAPK1抑制剂U0126处理后,细胞的迁移能力及炎症反应均有所改善,这表明丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)信号通路可能参与胎盘的侵袭异常、炎症反应等病理过程^[33-34];AKT1是PI3K-AKT信号通路的关键蛋白,通过啮齿动物和人类滋养层细胞的研究发现,AKT1与胎盘滋养层细胞的侵袭、凋亡等生理功能有关,其中AKT1信号通路失调可导致复发性流产、先兆子痫和不孕等不良围产结局^[35]。此外,分子对接也进一步印证,核心方中的3种关键活性化合物与11个核心靶点结合良好,具有优良的治疗ICP潜力。

ICP是一种病因复杂的病症,其中高胆汁酸对滋养细胞的毒性和凋亡等机制被视为是ICP进展过程中的关键诱因,并对氧化应激、炎症因子释放等过程起到了显著的促进作用^[36]。本文中研究的GO功能富集分析表明,在BP、CC、MF方面,ICP参与凋亡、线粒体外膜和磷酸酶结合等生理和病理过程,这与ICP的发病机制相一致^[37]。KEGG通路富集分析提示,凋亡、PI3K-AKT等信号通路可能在核心方治疗ICP的生物学过程具有关键性作用。研究表明^[38],胎盘滋养细胞凋亡在妊娠期各种生殖疾病的发病机制中发挥了重要作用,若滋养细胞的增殖与凋亡动态平衡被破坏时,则可能引起胚胎发育异常、自然流产等并发症。因此,抑制HTR-8/SVneo细胞凋亡是妊娠期疾病的重要干预策略。既往研究表明,由于易感的遗传和环境因素,ICP患者和动物模型的胎盘滋养细胞均存在过度凋亡,并与胆汁酸水平的异常增加密切相关^[39],这可能是ICP产生不良妊娠结局的病理生理机制。因此,利用胆汁酸类似物TCA诱导HTR-8/SVneo细胞模拟ICP高胆酸微环境进行凋亡机制的相关研究。本文研究中,HTR-8/SVneo细胞经TCA诱导后细胞活性显著降低(P<0.01),且凋亡率和Bax/Bcl-2表达增加(P<0.01),经芹菜素干预后细胞活性增加可能是异常凋亡被抑制所引起的。另有研究表明,细胞凋亡的诱导与调控机制需要多种信号途径的共同参与,而PI3K-AKT信号通路是其中最重要的信号传导通路,并参与HTR-8/SVneo细胞的AKT级联激活进程和凋亡相关因子Bax、Bcl-2的释放^[40]。既往研究表明,胎盘滋养细胞激活PI3K-AKT信号通路后,Bax/Bcl-2蛋白表达量减少而抑制HTR-8/SVneo细胞凋亡,可促进细胞增殖,并改善复发性流产、妊娠期糖尿病等产科并发症^[41-42]。因此,本文研究进一步探究PI3K-AKT信号通路在芹菜素对TCA诱导HTR-8/SVneo细胞凋亡中的作用机制。本研究结果表明,HTR-8/SVneo细胞经TCA诱导后p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达降低(P<0.05),经芹菜素干预后p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT蛋白表达增加(P<0.01),Bax/Bcl-2蛋白表达减少(P<0.01),而PI3K抑制剂LY294002预处理可逆转芹菜素的抗凋亡作用。由此可知,芹菜素对HTR-8/SVneo细胞凋亡抑制而具有治疗ICP的潜力,其机制可能与激活PI3K-AKT信号通路有关。

5 结论

收起

综上所述,运用R语言数据挖掘技术对含黄芩-白术药对治疗ICP的临床试验类文献进行了方药规律和核心方挖掘,并结合网络药理学和体外实验初步揭示了芹菜素对HTR-8/SVneo细胞的抗凋亡作用与PI3K-AKT信号通路相关。但由于ICP文献处方、核心方活性成分和靶点信息更新仍在报道,而本细胞实验仅验证了核心方多活性成分中芹菜素的作用机制。因此,还需对其他活性成分和挖掘的中药方进行多方面体内外实验验证及临床研究评价。

基金

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2025年第25卷第18期

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doi: 10.12404/j.issn.1671-1815.2405545

接收时间：2024-07-23
首发时间：2025-12-17
出版时间：2025-06-28

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收稿日期：2024-07-23
修回日期：2025-03-28

基金

辽宁省教育厅面上项目(JYTMS20231383)

作者信息

沈阳药科大学生命科学与生物制药学院, 沈阳 110016

通讯作者:

^* 魏秀岩(1975—),女,汉族,辽宁沈阳人,博士,副教授。研究方向:中药药效学和机制。E-mail:wei_xiuyan@163.com。

参考文献

分享链接

https://castjournals.cast.org.cn/joweb/kxjsygc/CN/10.12404/j.issn.1671-1815.2405545

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

前项	后项	支持度/%	置信度/%	提升度	频次
黄芩,白术,栀子	→茵陈	72.06	97.56	1.03	49
大黄,黄芩,白术	→茵陈	57.35	100	1.03	39
甘草,黄芩,白术	→茵陈	55.88	100	1.03	38
大黄,黄芩,白术,栀子	→茵陈	44.12	100	1.03	30
茯苓,黄芩,白术,栀子	→茵陈	44.12	100	1.03	30
甘草,黄芩,白术,栀子	→茵陈	42.65	100	1.03	29

前项

后项

支持
度/%

置信
度/%

提升度

频次

黄芩,白术,栀子

→茵陈

72.06

97.56

1.03

大黄,黄芩,白术

→茵陈

57.35

100

1.03

甘草,黄芩,白术

→茵陈

55.88

100

1.03

大黄,黄芩,白术,栀子

→茵陈

44.12

100

1.03

茯苓,黄芩,白术,栀子

→茵陈

44.12

100

1.03

甘草,黄芩,白术,栀子

→茵陈

42.65

100

1.03

API浓度/(μmol·L^-1)	细胞活性/%
0	100.00±0.08
5	100.57±8.88
10	115.84±11.09^*
20	136.41±4.50^**
40	105.02±8.30
80	87.57±3.97^*

API浓度/(μmol·L^-1)

细胞活性/%

100.00±0.08

100.57±8.88

115.84±11.09^*

136.41±4.50^**

105.02±8.30

87.57±3.97^*

组别	浓度/(μmol·L^-1)	细胞活性/%
NC组	—	100.00±0.03
TCA组	100	58.07±3.28^**
10-API组	10	64.69±1.50^#
20-API组	20	75.76±2.08^##

组别

浓度/(μmol·L^-1)

细胞活性/%

NC组

—

100.00±0.03

TCA组

100

58.07±3.28^**

10-API组

64.69±1.50^#

20-API组

75.76±2.08^##

组别	浓度/(μmol·L^-1)	细胞凋亡率/%
NC组	—	7.33±1.52
TCA组	100	22.58±1.87^**
20-API组	20	12.33±3.55^##
LY294002组	5	25.61±2.92
LY294002+20-API组	5+20	20.72±2.33^▲

组别

浓度/(μmol·L^-1)

细胞凋亡率/%

NC组

—

7.33±1.52

TCA组

100

22.58±1.87^**

20-API组

12.33±3.55^##

LY294002组

25.61±2.92

LY294002+20-API组

5+20

20.72±2.33^▲

组别	浓度/(μmol·L^-1)	p-PI3K/ PI3K	p-AKT/AKT	Bax/Bcl-2
NC组	—	1.24±0.03	0.49±0.03	0.20±0.01
TCA组	100	1.11±0.02^*	0.40±0.01^*	2.76±0.16^**
20-API组	20	1.91±0.07^##	0.61±0.06^##	0.62±0.02^##
LY294002组	5	0.49±0.13^##	0.38±0.12	1.78±0.05^#
LY294002+20-API组	5+20	1.25±0.01^▲▲	0.55±0.07^▲	1.09±0.08^▲▲

组别

浓度/(μmol·L^-1)

p-PI3K/ PI3K

p-AKT/AKT

Bax/Bcl-2

NC组

—

1.24±0.03

0.49±0.03

0.20±0.01

TCA组

100

1.11±0.02^*

0.40±0.01^*

2.76±0.16^**

20-API组

1.91±0.07^##

0.61±0.06^##

0.62±0.02^##

LY294002组

0.49±0.13^##

0.38±0.12

1.78±0.05^#

LY294002+20-API组

5+20

1.25±0.01^▲▲

0.55±0.07^▲

1.09±0.08^▲▲