医用生物力学

脂双层流动性促进CD40L介导的细胞接触面形成

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马金辉 ¹ , 冯晶晶 ¹ , 蒋笑嫣 ¹ , 董晓婷 ¹ , 孙小夕 ² , 林蒋国 ² , 方颖 ¹^,^* , 吴建华 ¹^,^*

医用生物力学 | 论著 2025,40(5): 1303-1308

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医用生物力学 | 论著 2025, 40(5): 1303-1308

脂双层流动性促进CD40L介导的细胞接触面形成

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马金辉¹, 冯晶晶¹, 蒋笑嫣¹, 董晓婷¹, 孙小夕², 林蒋国², 方颖¹^,^*, 吴建华¹^,^*

作者信息

^1.华南理工大学　生物科学与工程学院，生物力学研究所，广州　510006

^2.广东省人民医院（广东省医学科学院）医学研究中心，广州　510080

通讯作者:

方颖，副教授，E-mail：yfang@scut.edu.cn；

吴建华，教授，E-mail：wujianhua@scut.edu.cn

为共同通信作者

Lipid Bilayer Fluidity Regulates CD40L-Mediated Cell Contact Interface Formation

Jinhui MA¹, Jingjing FENG¹, Xiaoyan JIANG¹, Xiaoting DONG¹, Xiaoxi SUN², Jiangguo LIN², Ying FANG¹, Jianhua WU¹

Affiliations

^1.Institute of Biomechanics, School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China

^2.Research Department of Medical Sciences, Guangdong Provincial People's Hospital (Guangdong Academy of Medical Sciences), Guangzhou 510080, China

出版时间: 2025-10-01 doi: 10.16156/j.1004-7220.2025.05.029

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摘要

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目的

研究脂双层流动性对β1整合素-CD40L相互作用及所介导的癌细胞接触面形成的调节机制。

方法

通过调节含有N-二硫代乙酰胺修饰的二油酰基甘油酰胺（DGS-NTA）含量，制备具不同流动性支撑脂双层膜。膜的功能化通过在膜上锚定具荧光标记的CD40L来实现。通过共聚焦显微成像与荧光恢复后光漂白实验，观察PC9细胞与功能化脂双层间的接触面形成，利用Zhu-Golan散点图提取黏附分子二维动力学数据。

结果

DGS-NTA含量与扩散系数呈负相关，膜的高流动性促进CD40L在接触面内聚集，扩大接触面积。对应于具有高、中、低流动性的3种脂双层而言，β1整合素-CD40L复合物的二维解离常数（2D K_d）分别约为13、31、65 molecules/μm²。

结论

高脂双层膜流动性促进游离CD40L分子扩散并聚集到细胞接触面内，导致β1整合素-CD40L相互作用及其介导的细胞接触面稳定性增强。

关键词

脂双层膜 / 流动性 / β1整合素 / 细胞接触面 / 二维解离动力学

Abstract

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Objective

To study how lipid bilayer fluidity modulates the interaction between β1 integrin and CD40L, as well as the formation of CD40L-mediated tumor cell contact interfaces.

Methods

Supported lipid bilayers (SLB) with different fluidities were prepared through adjusting the 1, 2-dioleoyl-sn-glycero-3-[N-(5-amino-1-carboxypentyl) iminodiacetic acid] succinyl nickel salt (DGS-NTA) content. The functionalization of lipid bilayers was achieved by anchoring fluorescently labeled CD40L molecules onto the membrane surface. The contact interface formation of PC9 cells on the functionalized lipid bilayers was observed through confocal fluorescence imaging and fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments, and data of two dimensional (2D) reaction kinetics of β1 integrin and CD40L were extracted from Zhu-Golan plots.

Results

The diffusion coefficient of molecules in lipid bilayer was negatively correlated with DGS-NTA content. High fluidity of lipid bilayer promoted CD40L accumulation at cell contact interface and expanded the cell contact area. The 2D dissociation constants (2D K_d) of β1 integrin-CD40L complexes were approximately 13, 31 and 65 molecules/μm² for the three lipid bilayers with high, moderate and low fluidities, respectively.

Conclusions

High fluidity of lipid bilayers significantly facilitates diffusion and aggregation of CD40L to the cell contact interface, thus enhancing β1 integrin-CD40L interaction and the stability of cell contact interfaces.

Key words

lipid bilayer / fluidity / β1 integrin / cell contact area / two-dimensional (2D) dissociation kinetics

引用本文

马金辉, 冯晶晶, 蒋笑嫣, 董晓婷, 孙小夕, 林蒋国, 方颖, 吴建华. 脂双层流动性促进CD40L介导的细胞接触面形成. 医用生物力学, 2025 , 40 (5) : 1303 -1308 . DOI: 10.16156/j.1004-7220.2025.05.029

Jinhui MA, Jingjing FENG, Xiaoyan JIANG, Xiaoting DONG, Xiaoxi SUN, Jiangguo LIN, Ying FANG, Jianhua WU. Lipid Bilayer Fluidity Regulates CD40L-Mediated Cell Contact Interface Formation[J]. Journal of Medical Biomechanics, 2025 , 40 (5) : 1303 -1308 . DOI: 10.16156/j.1004-7220.2025.05.029

正文

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肿瘤细胞在体内逃避免疫清除是其实现长期生存和远端转移的关键策略，胞间接触引发的分子识别与黏附过程是免疫逃逸发生的早期事件^[1-2]。研究表明，血小板在肿瘤转移的早期阶段可能发挥了保护伞作用，通过与循环中的肿瘤细胞形成稳固聚团结构，阻止自然杀伤细胞和巨噬细胞等识别攻击^[3-4]。在这一过程中，血小板高表达的CD40L被认为是介导细胞黏附和胞间信号传导的关键分子，通过与多种肿瘤细胞表面的整合素家族成员（尤其是β1整合素）结合，形成稳定的胞间结构，协助肿瘤细胞“披上”免疫屏障，影响肿瘤进程^[5-7]。

β1整合素是一类跨膜黏附受体，在多种实体瘤中表达升高，与侵袭性、耐药性和差预后密切相关，参与调控细胞与细胞外基质的黏附、迁移和信号转导等过程^[8-9]。作为经典的免疫调节因子，CD40L在激活的血小板上高表达，它除了在T细胞与抗原提呈细胞相互作用过程中发挥免疫协同作用外，还被发现与肿瘤相关的黏附行为密切相关^[10-11]。然而，目前关于CD40L与β1整合素在二维细胞接触面上的结合亲和力及其调控机制的研究还较少报道。体外模拟这一分子结合事件的理想平台是支撑脂双层膜（supported lipid bilayer，SLB）模型。该模型能够模拟细胞膜的基本结构特征，具有横向流动性好、表面可修饰性强等优点，广泛应用于研究膜蛋白行为、分子识别以及细胞黏附等领域^[12-13]。细胞膜的物理属性（尤其是膜脂流动性）对蛋白质结合动力学具有显著影响，高流动性环境有助于配体向受体富集区域的快速迁移，从而提高配体-受体的有效结合效率^[14-15]。此外，为了定量评估配体与受体的二维结合特性，Zhu-Golan图分析法被提出并广泛应用于细胞-表面界面中的亲和力测定，该方法基于荧光信号反推出结合/游离配体密度，以获取二维解离常数（two-dimensional dissociation constant，2D K_d）^[16-17]。

本文应用所制备的具有不同流动性、功能化（或锚定荧光标记CD40L蛋白）SLB模型，在不同膜流动性条件下，研究加载到SLB上、高表达β1整合素的肺腺癌细胞PC9细胞接触面形成及其动力学机制，通过模拟肿瘤细胞-血小板之间的初始黏附事件，揭示脂双层流动性对受体-配体相互作用及其所介导的细胞接触面形成的调节功能，为理解肿瘤免疫逃逸中的黏附机制提供新见解与方法学支撑。

1　材料与方法

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1.1　细胞、蛋白与试剂

富含β1整合素的PC9细胞（人肺腺癌细胞株）购自中国科学院细胞库，培养于含10%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）（Bioexplorer公司，美国）及5%青链霉素（PS，北京索莱宝科技有限公司）的高糖DMEM培养基（Gibco公司，美国），37 ℃、5%CO₂恒温培养箱中。1，2-油-锡-磷脂-3-卵磷脂（DOPC）与镍盐修饰脂（DGS-NTA-Ni）购自美国Avanti Polar Lipids公司，Alexa Fluor^® 488蛋白标记试剂盒、PBS缓冲液购自美国Life Technologies公司，His标签重组人源CD40L蛋白购自北京义翘神州科技股份有限公司，单克隆抗体Anti-Integrinβ1购自美国BioLegend公司，载玻片购自美国Warner Instruments公司。

1.2　SLB构建、功能化及流动性检测

按照摩尔比98∶2、91∶9、84∶16混合DOPC与DGS-NTA，制成脂质溶液并真空旋蒸成膜。干膜经磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）重悬并超声处理制得小单层囊泡（small unilamellar vesicle，SUV），离心去除杂质后，滴加于经硫酸清洗处理的玻璃表面，37 ℃静置5 min形成SLB。为阻断非特异性结合，膜表面以2%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）封闭。随后，向SLB中添加25、50、75 nmol/L的Alexa Fluor^® 488标记CD40L，依靠His-Ni系统实现蛋白锚定，锚定完成后以PBS清洗去除游离蛋白。功能化（或锚定CD40L）脂双层的流动性或扩散系数通过荧光淬灭后恢复（fluorescence recovery after photobleaching，FRAP）实验来检测。

1.3　细胞接触面形成实验

将对数生长期PC9细胞经胰酶消化后重悬于PBS中，制备细胞悬浮液（1×10⁴/mL）。将细胞滴加至已锚定CD40L的SLB表面。利用TCS SP8共聚焦激光扫描显微镜（Leica公司，德国），记录脂双层膜焦平面处荧光信号，观察细胞接触面区域面积与荧光强度随时间的演化。实验在不同脂双层流动性与不同CD40L分子浓度条件下进行。

1.4　二维亲和力分析与Zhu-Golan图绘制

结合前期建立的荧光位点换算公式^[14-15]，分别计算结合配体密度（B）、游离配体密度（F）与接触面积占比p（p=细胞接触面积/细胞截面积），构建以B×p为横轴、B/F为纵轴的Zhu-Golan图。经线性回归后取斜率的负倒数，得出二维解离常数（2D K_d），用于表征β1整合素-CD40L的结合亲和力。

1.5　图像采集与数据处理

荧光图像采集在激光共聚焦显微镜下进行，使用100×油镜记录细胞接触面荧光图。所有成像参数保持一致，以确保数据可比性。图像分析采用ImageJ软件测量荧光强度与接触面积，计算接触面荧光信号与接触面积占比等关键指标。荧光强度与CD40L浓度的线性关系用于后续二维亲和力计算，所有实验数据取3次独立重复的平均值。

1.6　数据统计分析

实验重复3次以上，所有数据以（平均值±标准差）表示。组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），多组间采用Tukey检验，双组数据比较使用双尾t检验。荧光恢复曲线拟合与2D K_d计算均在GraphPad Prism 9.0中完成。

2　结果

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2.1　3种功能化（或锚定有50 nmol/L蛋白CD40L）脂双层的扩散系数具有显著差异

SLB因其结构稳定且具备良好的横向分子流动性，已被广泛应用于模拟细胞膜微环境、研究膜蛋白锚定与扩散行为等领域^[18]。本文成功构建了3种功能化SLB（DOPC与DGS-NTA摩尔比分别为98∶2、91∶9和84∶16）。FRAP实验结果显示，功能化或锚定有50 nmol/L荧光标记CD40L脂双层的荧光恢复能力随DGS-NTA含量上升而下降，高流动性组（2%DGS-NTA）恢复速率快；最大恢复率高，达到了（92.16±2.83）%；扩散系数最大，为（1.6±0.11）μm²/s。而低流动性组（16%DGS-NTA）扩散显著减缓，荧光恢复率仅为（66.17%±4.34）%。无流动性对照组（经空气氧化处理的脂双层组）几乎无恢复，扩散系数仅为（0.18±0.02）μm²/s，这与流动性越强扩散能力越大的预期一致[见图1（a）、（b）]。组间比较结果进一步证实，各实验组与无流动性组在未恢复荧光比例和扩散系数方面的显著性差异（P<0.001）[见图1（c）、（d）]。上述结果提示，本文所构建的功能化的脂双层具有显著不同的流动性或扩散能力，可以用以模拟具有不同流动性的细胞膜上配（受）体介导的细胞生物学过程。

2.2　脂双层流动性促进CD40L介导的细胞接触面形成和稳定

经由受体-配体相互作用的介导的细胞接触面的形成，不仅和跨膜配体表达水平密切相关，而且受到细胞膜物理特性的调控^[19]。细胞接触面通常受到黏附分子结合亲和力的调控，亦与细胞接触面稳定性密切相关^[20]。为揭示细胞膜流动性对肿瘤细胞接触面形成及其稳定性的影响，本文观测了分别锚定有25、50和75 nmol/L荧光标记CD40L的功能化脂双层与PC9细胞之间接触面的形成演化。结果表明，当PC9细胞接触到锚定有50 nmol/L荧光标记CD40L的功能化脂双层之后，它将迅速形成自己的细胞接触面（荧光区域），该接触面先快速后平缓地增加，直至稳定为止，需要5~6 min；当对经β1整合素抗体预处理后的PC9或经空气氧化处理的脂双层而言，细胞接触面上的荧光团无法形成，提示CD40L通过特异性地与β1整合素结合，介导PC9的黏附和稳定细胞接触面的形成。同时，脂双层的流动性，对CD40L聚集到细胞接触面并导致稳定的细胞接触面形成，是必不可少的；另一方面，随着脂双层DGS-NTA含量减低或脂双层流动性（扩散系数）增大，细胞接触面内的荧光影像变得越大越明亮，提示脂双层流动性促进CD40L积聚到细胞接触面之内，促进稳定细胞接触面的形成[见图2（a）、（b）]。

本文发现，相对荧光强度和细胞接触面积占比随脂双层DGS-NTA含量降低或随CD40L浓度上升而增加，提示CD40L介导的PC9细胞接触面及其稳定性，不但呈现流动性增强型特征，而且受到脂双层CD40L水平的正向调控[见图2（c）、（d）]。本文推测，良好的流动性有助于接触面外的游离（未结合受体的）CD40L分子进入细胞接触面，获得与受体结合的机会，而高的游离CD40L分子密度，有助于形成更多的黏附分子键，导致更稳固和更大的细胞接触面的形成。

2.3　脂双层膜流动性调节β1整合素-CD40L二维结合亲和力

为揭示脂双层膜流动性对β1整合素-CD40L复合物二维结合亲和力的影响，采用基于Zhu-Golan图的二维结合动力学模型，分析在不同荧光标记蛋白CD40L浓度（10、25、50、75、100 nmol/L）条件下所获得的细胞在3种具有不同流动性功能化脂双层上的细胞接触面积与细胞强度的测量值。结果表明，在流动性不变的条件下，功能化脂双层的荧光强度随CD40L浓度的增加而线性增加；流动性的增加，会提高SLB荧光强度的水平，但不会改变SLB荧光强度与游离CD40L浓度的线性依赖关系[见图3（a）]。该结果提示，在25~100 nmol/L的CD40L浓度范围内，功能化的脂双层具有良好的流动性/扩散能力。同时，通过利用游离配体密度（F）、接触面区域结合配体密度（B）和接触面面积占比（p）等数据，构建基于Zhu-Golan图的β1整合素-CD40L的二维动力学模型[见图3（b）]，得到复合物解离常数（2D K_d）的信息。结果表明，高、中和低脂双层流动性分别对应的β1整合素-CD40L复合物的2D K_d值分别为（13.25±1.4）、（30.64±2.65）、（64.93±13.24）molecules/μm²。本文认为，脂双层流动性越高，2D K_d值越小，复合物更稳定而不易解离，具有更高的结合亲和力[见图3（c）]。

3　讨论

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作为重要调控因素，细胞膜流动性介导了跨膜物资输运，促进细胞识别、融合与跨膜信号传导等系列细胞生物学过程。CD40L介导的血小板-癌细胞接触面的形成，是癌细胞免疫逃逸过程中的重要事件，不但受到β1整合素-CD40L二维反应动力学的调控，而且与细胞膜流动性密切相关。作为研究受体-配体二维反应动力学的体外技术平台，已被广泛应用于许多分子系统，如T细胞受体/pMHC和CD2/CD58^[21-22]。为查明尚不明晰的流动性对β1整合素-CD40L复合物二维结合亲和力的调控机制，本文通过构建并应用支撑性脂双层膜模型，结合共聚焦成像、FRAP分析与Zhu-Golan图等方法，较深入地观测和分析了膜面流动性对CD40L介导的PC9细胞接触面形成及其动力学机制，发现β1整合素-CD40L相互作用具有显著的脂双层流动性增强型特征。值得说明的是，本文中构建的功能化脂双层膜模型主要用于模拟血小板膜上CD40L分子的横向扩散行为，而非反映PC9细胞自身膜流动性状态。PC9细胞在实验中作为β1整合素阳性受体细胞，其膜性质在各实验组保持一致，因此脂双层流动性变化可被视为唯一变量，便于解析其对受体-配体相互作用的直接影响。

本文结果表明，对3种具有不同流动性的功能化脂双层而言，流动性越高，接触面外游离的CD40L聚集到细胞接触面内的能力越强，促进β1整合素-CD40L复合物的形成和聚集的效果越显著，形成的细胞接触面越大、越稳定。这一结果与以往研究中关于膜面分子扩散促进结合亲和力的观点相吻合^[23-24]，展现了膜物理性质在细胞信号调控中的重要地位。可以猜想，作为CD40L的主要受体，β1整合素构象转变可能是流动性增强型细胞接触面形成的另一个分子调控机制。自由的或静息的整合素分子，通常处于弯曲的低亲和力状态，它与配体结合后，受到力化学信号刺激而激活成高亲和力构象，促进细胞稳定黏附与下游跨膜信号转导^[25-26]。膜的流动性环境，增加了CD40L遭遇、识别并激活β1整合素的机会，而激活了的β1整合素将具有更高的与CD40L结合的亲和力，形成更稳定的细胞接触面与跨膜通讯。需要指出的是，尽管体外实验结果显示脂双层流动性越高越有利于细胞接触面的形成，但在真实的体内环境中，膜流动性可能存在一个最适区间。过高的流动性可能导致受体配体解离率升高，反而不利于黏附稳定性，这提示未来应在更复杂的仿生微环境中进一步探讨该调控机制的生理适应性。

本文结果表明，基于功能化脂双层与FRAP实验技术的研究黏附分子二维反应动力学的技术研究路线是可行的。但是，不仅在体外构建的脂双层与细胞膜之间，而且在体外实验环境与肿瘤生理病理微环境之间的差异，均有显著差异，这将导致本文所展示结果的局限性。此外，由于本文聚焦于建立基础模型并验证β1整合素-CD40L黏附机制，因此仅选用PC9细胞作为代表性高表达β1整合素的肿瘤模型。未来可考虑引入膜流动性差异更显著的其他肿瘤细胞（如胶质瘤、乳腺癌细胞等）进行横向验证，以拓展该机制的通用性和生理适应性。最后，膜的黏度、膜张力及细胞所处血流力学微环境等，均可能影响黏附分子的二维反应动力学行为^[27-28]。因此，考虑复杂肿瘤细胞与血小板力学微环境、基于功能化脂双层模型的二维反应动力学处理技术的发展，具有十分重要意义。

4　结论

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血小板CD40L介导的细胞接触面的形成，是癌细胞免疫逃逸过程中的关键早期事件。基于所构建的、可调控流动性的功能化脂双层膜模型和FRAP实验技术，本文发现，高的脂双层流动性将导致细胞接触面外的游离CD40L扩散并聚集到细胞接触面内、促进β1整合素和CD40L的结合，更易形成稳定的细胞接触面，并可测得β1整合素-CD40L复合物的二维解离常数（2D K_d）。这一工作将有助于更深入理解血小板介导的癌细胞免疫逃逸的动力学机制，促进力学免疫学的发展。

基金

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国家自然科学基金项目(12172137; 12072117)

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2025年第40卷第5期

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doi: 10.16156/j.1004-7220.2025.05.029

接收时间：2025-05-18
首发时间：2026-03-27
出版时间：2025-10-01

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收稿日期：2025-05-18
修回日期：2025-06-05

基金

国家自然科学基金项目(12172137; 12072117)

作者信息

^1.华南理工大学　生物科学与工程学院，生物力学研究所，广州　510006

^2.广东省人民医院（广东省医学科学院）医学研究中心，广州　510080

通讯作者:

方颖，副教授，E-mail：yfang@scut.edu.cn；

吴建华，教授，E-mail：wujianhua@scut.edu.cn

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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