微生物学杂志

基于启动子定向进化的葡萄糖-6-磷酸异构酶高效分泌表达体系的构建

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游文慧 ¹^,² , 付刚 ²^,³^,⁴^,⁵^,^* , 张大伟 ¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,^*

微生物学杂志 | 研究报告 2026,46(2): 14-24

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微生物学杂志 |研究报告 2026 , 46 (2) : 14 -24

基于启动子定向进化的葡萄糖-6-磷酸异构酶高效分泌表达体系的构建

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游文慧¹^,², 付刚²^,³^,⁴^,⁵^,^*, 张大伟¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,^*

作者信息

^1．大连工业大学生物工程学院，辽宁大连　116034

^2．中国科学院天津工业生物技术研究所，天津　300308

^3．中国科学院大学，北京　100049

^4．低碳合成工程生物学全国重点实验室中国科学院工业生物技术研究所，天津　300308

^5．国家合成生物技术创新中心，天津　300308

^6．天津科技大学生物工程学院，天津　300457

通讯作者:

^* 通讯作者。付刚，男，副研究员，硕士。主要研究方向为枯草芽孢杆菌表达系统构建与微生物代谢工程。E-mail: fu_g@tib.cas.cn

张大伟，男，研究员，博士。主要研究方向为微生物代谢工程与合成生物学。Tel: 022-24828749，E-mail: zhang_dw@tib.cas.cn

作者简介:

游文慧　女，硕士研究生。主要研究方向为枯草芽孢杆菌表达系统。E-mail: youwh24@tib.cas.cn

Development of an Efficient Secretory Expression System for Glucose-6-Phosphate Isomerase Based on Promoter Directed Evolution

Wen-hui YOU¹^,², Gang FU²^,³^,⁴^,⁵^,^*, Da-wei ZHANG¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,^*

Affiliations

^1.School of Bio-Engineering, Dalian University of Technology, Dalian 116034

^2.Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308

^3.University of Chinese Academy of Science, Beijing 100049

^4.Key Laboratory of Engineering Biology for Low-Carbon Synthesis Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308

^5.National Center of Technology Innovation for Synthetic Biology, Tianjin 300308

^6.College of Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457

出版时间: 2026-04-20 doi: 10.3969/j.issn.1005-7021.2026.02.002

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摘要

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为提升诱导型启动子P_malA的表达强度并实现目标蛋白的高效胞外表达，基于前期所构建的麦芽糖诱导型表达系统（MATE表达系统），通过易错PCR构建启动子突变文库，并以绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein, GFP）为报告蛋白筛选高表达突变体，获得突变位点位于-35区域的增强型启动子M3。以M3为调控元件构建目标酶葡萄糖-6-磷酸异构酶（Pgi）表达载体，融合Sec型信号肽AmyS实现其胞外分泌表达。通过添加不同碳源进行诱导表达优化，筛选出适配性最优条件后，在3 L发酵罐中进行高密度发酵，Pgi产量达7.26 g/L。功能验证表明，本体系表达的Pgi催化活性与大肠埃希菌（Escherichia coli）对照表达体系相当，说明该系统在提升表达强度的同时保持了蛋白功能的稳定性。本研究构建了一个优化后的高效MATE表达体系，为代谢工程中关键酶的高效表达提供了可行路径，并为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）在工业酶制剂开发中的应用提供了支撑。

关键词

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） / MATE表达系统 / 启动子突变 / 葡萄糖-6-磷酸异构酶 / 培养基优化

Abstract

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To enhance the transcriptional strength of the inducible promoter P_malA and achieve efficient extracellular expression of target proteins, in this study, error-prone PCR was employed to construct a promoter mutant library based on a previously established maltose-inducible expression system (MATE expression system). Using green fluorescent protein (GFP) as a reporter protein, a high-expression mutant designated as M3, harboring a single-base substitution in the-35 region, was identified. The mutant promoter M3 was then utilized as a regulatory element to construct a recombinant expression vector for glucose-6-phosphate isomerase (phospho-glucose isomerase, Pgi), which was fused at its N-terminus to the Sec-type signal peptide AmyS to facilitate secretion. To further optimize inducible expression, various carbon sources were evaluated, and the optimal condition was applied in a 3-L bioreactor for high-density fermentation, yielding a maximum Pgi titer of 7.26 g/L. Functional assays confirmed that the catalytic activity of Pgi expressed in this system was comparable to that of the control produced in Escherichia coli, indicating that enhanced expression did not compromise protein functionality. This study establishes an optimized and efficient MATEbased expression system, offering a feasible strategy for high-level expression of key enzymes in metabolic engineering and supporting the application of Bacillus subtilis in the development of industrial enzyme preparations.

Key words

Bacillus subtilis / MATE expression system / promoter mutation / glucose-6-phosphate isomerase / medium optimization

引用本文

游文慧, 付刚, 张大伟. 基于启动子定向进化的葡萄糖-6-磷酸异构酶高效分泌表达体系的构建. 微生物学杂志, 2026 , 46 (2) : 14 -24 . DOI: 10.3969/j.issn.1005-7021.2026.02.002

Wen-hui YOU, Gang FU, Da-wei ZHANG. Development of an Efficient Secretory Expression System for Glucose-6-Phosphate Isomerase Based on Promoter Directed Evolution[J]. Journal of Microbiology, 2026 , 46 (2) : 14 -24 . DOI: 10.3969/j.issn.1005-7021.2026.02.002

基金

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中国科学院战略性先导科技专项(XDC0120203)
天津市科技计划项目(24ZYCGYS00690)

参考文献

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排序方式：

2026年第46卷第2期

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109

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doi: 10.3969/j.issn.1005-7021.2026.02.002

接收时间：2025-05-20
首发时间：2026-10-10
出版时间：2026-04-20

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作者

出版历史

收稿日期：2025-05-20

基金

中国科学院战略性先导科技专项(XDC0120203)

天津市科技计划项目(24ZYCGYS00690)

作者信息

^1．大连工业大学生物工程学院，辽宁大连　116034

^2．中国科学院天津工业生物技术研究所，天津　300308

^3．中国科学院大学，北京　100049

^4．低碳合成工程生物学全国重点实验室中国科学院工业生物技术研究所，天津　300308

^5．国家合成生物技术创新中心，天津　300308

^6．天津科技大学生物工程学院，天津　300457

通讯作者:

^* 通讯作者。付刚，男，副研究员，硕士。主要研究方向为枯草芽孢杆菌表达系统构建与微生物代谢工程。E-mail: fu_g@tib.cas.cn

张大伟，男，研究员，博士。主要研究方向为微生物代谢工程与合成生物学。Tel: 022-24828749，E-mail: zhang_dw@tib.cas.cn

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/wswxzz/CN/10.3969/j.issn.1005-7021.2026.02.002

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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