热带作物学报

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橡胶树热诱导启动子的筛选及初步鉴定

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王文平 ¹ , 罗小梅 ¹ , 曹杰 ¹^,² , 张盛敏 ¹^,² , 戚继艳 ¹^,² , 张义 ¹^,²^,^*

热带作物学报 | 组学与生物技术 2025,46(5): 1025-1031

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热带作物学报 |组学与生物技术 2025 , 46 (5) : 1025 -1031

橡胶树热诱导启动子的筛选及初步鉴定

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王文平¹, 罗小梅¹, 曹杰¹^,², 张盛敏¹^,², 戚继艳¹^,², 张义¹^,²^,^*

作者信息

^1.海南大学热带农林学院（农业农村学院、乡村振兴学院），海南海口　570228

^2.海南大学三亚南繁研究院，海南三亚　572025

通讯作者:

^* 张义（ZHANG Yi），E-mail：hudazhangyi@126.com。

Screening and Prelininary Identification of a Heat-Inducible Promoter of Hevea

Wenping WANG¹, Xiaomei LUO¹, Jie CAO¹^,², Shengmin ZHANG¹^,², Jiyan QI¹^,², Yi ZHANG¹^,²^,^*

Affiliations

^1.School of Tropical Agriculture and Forestry (Agriculture and Rural College, Rural Revitalization College), Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China

^2.Sanya Institute of Breeding and Multiplication, Hainan University, Sanya, Hainan 572025, China

出版时间: 2025-05-25 doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.05.001

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摘要

收起

基因工程技术是缩短作物育种周期、定向培育农作物新品种的有效途径，也是鉴定植物基因功能的重要手段。诱导型启动子是基因工程研究的重要工具，其中热诱导启动子由于其载体结构简单，诱导方便，成本低，在植物分子生物学领域广泛使用。目前，橡胶树基因工程技术发展相对滞后，目的基因功能研究通常一般使用组成型启动子，限制了相关工作的开展。本研究对橡胶树愈伤组织进行热处理，通过转录组测序分析，筛选出8个热诱导前不表达或几乎不表达，但热诱导后表达量较高的基因；经过热诱导表达量变化和特异性评价，鉴定出2个特异性响应热处理的候选基因HbHSP17.6B和HbHSP17.6C；进一步通过巢式PCR克隆出HbHSP17.6C起始密码子上游1962 nt的启动子序列，确认其由核心转录区和多个顺式作用元件等组成，命名为pHbHSP17.6C。分析该启动子可用于橡胶树及其他近源植物基因功能研究，有望为相关研究提供新的工具选择。

关键词

橡胶树 / 愈伤组织 / 热诱导启动子

Abstract

收起

Genetic engineering technology serves as an effective method to shorten crop breeding cycles, specifically cultivate new crop varieties, and identify plant gene functions. Induced promoters are important tools in genetic engineering research, among which thermally inducible promoters being extensively utilized in plant molecular biology owing to the simple vector structure, convenient induction, and low cost. At present, the development of genetic engineering technology in rubber trees lags behind. Functional studies of target genes typically use constitutive promoters, which limits the progress of related work. In this study, rubber tree calli were treated by heat. Through transcriptome sequencing analysis, identified eight genes that were non-expressed or minimally expressed, but exhibited high level expression after heat induction in calli. After heat induced expression changes and specificity evaluation, two candidate genes HbHSP17.6C and HbHSP17.6B that specifically respond to heat treatment were identified. Further through nested PCR, we cloned the 1962 nt sequence upstream of the start codon of the heat shock protein gene HbHSP17.6C. Confirm that it is composed of a core transcription region and multiple cis acting elements, and is named pHbHSP17.6C. It is inferred that this promoter could be used for gene function research in rubber trees and other closely related plants, which is expected to provide new tool options for related research.

Key words

rubber tree / callus / heat-inducible promoter

引用本文

王文平, 罗小梅, 曹杰, 张盛敏, 戚继艳, 张义. 橡胶树热诱导启动子的筛选及初步鉴定. 热带作物学报, 2025 , 46 (5) : 1025 -1031 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.05.001

Wenping WANG, Xiaomei LUO, Jie CAO, Shengmin ZHANG, Jiyan QI, Yi ZHANG. Screening and Prelininary Identification of a Heat-Inducible Promoter of Hevea[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2025 , 46 (5) : 1025 -1031 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.05.001

正文

收起

天然橡胶是战略性工业原料^[1]，但我国天然橡胶自给率常年低于15%。橡胶树是天然橡胶的主要来源，为热带乔木，传统杂交育种周期需要21~30 a^[2]。近年来，随着分子生物学等学科的发展，特别是橡胶树基因组学方面的研究，天然橡胶生物合成通路的解析已经比较清楚^[3]，但其产量形成机制、主要病害的致病机理、抗寒及抗风分子机制等方面尚不明确。

启动子是植物基因工程技术中用来驱动目标基因表达的关键工具，不同类型启动子的作用机制不同。其中，诱导型启动子只能在诱导条件满足时，才能诱导外源基因高效表达，因此在基因功能鉴定和分子育种方面具有重要意义^[4]。常见的诱导型启动子类型主要有：化学诱导型、物理诱导型、生物胁迫诱导型等^[5]。橡胶树是典型的热带植物，耐热性较好，而热诱导启动子具有系统简洁、载体易构建、诱导条件容易满足等优点^[6]，因此该类启动子在橡胶树基因工程研究中有良好的应用前景。

目前，在橡胶树基因工程研究中，通常使用花椰菜花叶病毒的35S启动子和橡胶树内源的组织特异性启动子来开展相关工作，未见诱导性启动子的应用报道^[7-9]。因此，本研究开展热处理条件下橡胶树差异基因表达分析和热诱导启动子的筛选、鉴定工作，以期为相关研究提供新的工具选择。

1　材料与方法

收起

1.1　材料

供试植物材料为实验室继代培养的橡胶树愈伤组织细胞系073、084、340和363，培养条件为27 ℃暗培养。这4个细胞系来自于橡胶树品种热研7-33-97不同内珠被的不同部位，其体胚发生效率高，是用于橡胶树转基因操作的优良受体。参照LUO等^[10]的方法，制备橡胶树愈伤组织增殖培养基以及农杆菌浸染相关的脱毒培养基和筛选培养基。转化所用农杆菌菌株为EHA105（携带有pCAMBIA2300质粒）。

RNAprep Pure多酚多糖植物总RNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，Prime STAR HS DNA Polymerase购自宝日医生物技术北京有限公司，2×ES Taq MatserMix（Dye）购自康为世纪生物科技股份有限公司，RNA反转录试剂盒Hiscript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）、实时荧光定量PCR试剂盒ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、Q711和FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit产物纯化试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，pEASY-Blunt Zero Cloning Kit购自北京全式金生物技术股份有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.2　方法

1.2.1　愈伤组织热处理条件筛选

将继代培养1周后的橡胶树4个细胞系的愈伤组织于42 ℃进行暗培养热处理，时间设3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36 h。处理完毕进行继代培养，第3周后观察其生长状态是否正常。

1.2.2　橡胶树愈伤组织中热激活表达基因的筛选

将增殖培养14 d后的橡胶树4个愈伤组织细胞系分别在42 ℃条件下处理3 h，收集未处理及热处理愈伤组织，提取RNA并测序，将未处理和热处理后的基因表达数据进行比较分析，筛选出未处理愈伤中不表达且热处理后激活表达的基因作为候选基因。

1.2.3　候选基因表达特异性分析

将增殖培养14 d后的橡胶树4个愈伤组织细胞系，分别在42 ℃条件下处理2 h，37 ℃条件下处理2 h；将预培养（无Ag⁺）14 d后的橡胶树4个愈伤组织细胞系进行农杆菌侵染处理，浸染方法参照LECLERCQ等^[11]的报道；侵染后在20 ℃条件下共培养3 d，然后进行脱毒培养，21 d后进行筛选培养。分别收集以上不同处理阶段的橡胶树愈伤组织，液氮速冻后于–80 ℃暂存，用于RNA提取，通过实时荧光定量PCR检测候选基因的表达特性。

1.2.4　愈伤组织RNA的提取及测序

取1~2 g不同处理的橡胶树愈伤组织，液氮研磨后，参照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，使用Infinite 200 pro检测RNA的浓度和纯度。将其中未处理及42 ℃处理3 h后的4个细胞系的RNA样品送北京格致博雅生物科技有限公司进行转录组数据测序。

1.2.5　实时荧光定量PCR

将1.2.2中得到的候选基因的氨基酸序列，在公共数据库Tair（https://www.arabidopsis.org/）中进行BLASTP检索，参考结果中排名第一位的拟南芥基因的名称，对这些热激活表达的基因命名。根据热研7-33-97基因组注释信息，检索出这些候选基因的cDNA序列，设计实时荧光定量PCR引物（表1）。分别取1 μg不同样品的总RNA进行反转录，将反转录获得的cDNA稀释50倍，使用实时荧光定量PCR试剂盒对热激活表达基因进行表达丰度检测。实时荧光定量PCR程序采用诺唯赞标准程序^[10]，反应结束后，采用2^-ΔΔCt值法计算各个不同处理阶段样品的相对表达量。

1.2.6　热诱导启动子克隆

根据荧光定量PCR验证结果，筛选出特异性好、热处理诱导下表达量高的目标基因。以这些基因的cDNA序列对橡胶树热研7-33-97基因组进行本地BLASTN比对，提取其起始密码子上游2000 nt序列作为其启动子序列。根据该序列设计巢式PCR引物（表1），以基因组DNA为模板，进行启动子的PCR扩增。扩增得到的第二轮PCR产物经检测后送至广州生工生物技术有限公司测序。

1.2.7　热诱导启动子序列验证及分析

以特异性应答热处理表达基因的cDNA序列，设计引物（表1）扩增出热激活特异性表达基因的cDNA全长。使用2×ES Taq Matser Mix（Dye），以42 ℃ 3 h热处理过后084细胞系的cDNA作为模板，扩增得到PCR产物的检测、纯化、测序同1.2.5。根据热激活特异性表达基因的gDNA序列设计跨启动子和外显子克隆基因全长的引物（表1）。使用100 ng热研7-33-97的gDNA作为模板进行PCR扩增，PCR产物的检测、纯化、测序同1.2.5。使用PlantCare（https://www.plantcare.co.uk/）在线分析工具对启动子序列进行顺式作用元件检索分析。

2　结果与分析

收起

2.1　热处理激活表达基因的筛选

研究发现，橡胶树愈伤组织在42 ℃进行不同时间处理后，发现热处理36 h以内，愈伤组织生长情况无明显差异，因此选择3 h作为后续转录组测序的热处理时间。将4个愈伤组织细胞系42 ℃处理3 h的所有基因的FPKM值进行比较分析发现，未处理不表达或几乎不表达而热处理诱导表达的基因并不多。HbHSP17.6C、HbHSP17.6B、EVM0006300、EVM0006899、EVM0017927、EVM0020623、EVM0012326和EVM0003506是排名靠前的8个基因，4个愈伤组织中的结果基本一致。其中，HbHSP17.6C和HbHSP17.6B基因未处理和热处理过后表达量变化最大，其他6个基因热处理后的表达量并不高（图1）。

克隆热诱导启动子的最终目的是应用其作为橡胶树基因工程技术中控制目的基因表达的分子开关。理想的热启动子在愈伤组织中应该特异性响应热激活，愈伤组织继代培养过程（有/无Ag⁺），以及转基因过程中的各种环境变化都不应该激活该启动子。本研究对愈伤组织进行了多种条件的处理，包括温度变化、不同类型的培养基、农杆菌浸染、脱毒培养、筛选培养等。对上述8个热激活表达的候选基因进行RT-qPCR分析发现，只有HbHSP17.6C（图2）和HbHSP17.6B在愈伤中的表达特异性响应热激活，其他6个候选基因，愈伤组织在其他处理条件下也有低丰度的表达，说明其特异性不强。

2.2　热诱导基因启动子的克隆

以橡胶树热研7-33-97的基因组中检索到的HbHSP17.6C和HbHSP17.6B启动子序列设计2对PCR引物，通过巢式PCR扩增HbHSP17.6C基因的启动子序列片段，成功克隆得到了HbHSP17.6C基因的启动子片段，但未能获得HbHSP17.6B的启动子片段。PCR产物纯化、克隆后，序列分析发现克隆出HbHSP17.6C基因起始密码子上游的1962 nt的序列。

2.3　 HbHSP17.6C基因的cDNA和启动子序列的验证

橡胶树基因组比对结果显示，HbHSP17.6C基因只有1个外显子，没有内含子。以橡胶树愈伤组织热处理后的cDNA作为模板，PCR扩增获得HbHSP17.6C基因的cDNA全长。通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测，成功克隆得到了428 nt的目标片段。测序结果显示，该序列包含HbHSP17.6C基因的411 nt的编码序列全长，在拟南芥数据库（Tair）中进行检索分析，HbHSP17.6C是拟南芥AtHSP17.6C（AT1G53540.1）的同源基因，氨基酸序列一致性为59%。以橡胶树热研7-33-97基因组DNA为模板，使用引物20582F2和20582R2-2进行PCR扩增，成功克隆得到了包含HbHSP17.6C基因的启动子区和编码区序列的2360 nt的片段。测序分析显示，克隆的1962 nt启动子序列位于HbHSP17.6C基因编码序列的起始密码子的相邻上游，HbHSP17.6C基因只有1个外显子。

2.4　橡胶树pHbHSP17.6C热诱导启动子序列的顺式作用元件分析

通过启动子在线分析工具（Plantcare）检索发现，pHbHSP17.6C启动子序列的顺式作用元件根据分布密度可分为高、中、低3个明显的区域，分别是–1962~–1696 nt、–1695~–994 nt和–993~–1 nt，越靠近起始密码子密度越高（图3）。顺式作用元件分析显示，除了含有启动子的核心转录区TATA-box和启动子、增强子区域中常见的顺式作用元件CAAT-box外，还有参与脱落酸反应的ABRE顺式作用元件，参与光反应的顺式调控元件G-box、AE-box、Box 4、GATA-motif、GT1-motif、I-box、TCCC-motif顺式作用元件，厌氧诱导所必需的顺式调控元件ARE，与分生组织表达相关的顺式调控元件CAT-box，赤霉素反应元件GARE-motif，参与低温响应的顺式作用元件LTR，MYB结合位点参与干旱诱导MBS顺式作用元件，参与种子特异性调控的顺式调控元件RY-element，水杨酸反应性中的顺式作用元件TCA-element，60K蛋白结合位点的顺式作用元件Unnamed__1等类型，不含有已知的热反应顺式作用元件。

3　讨论

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本研究以橡胶树热研7-33-97的胚性愈伤组织为材料，热处理后通过转录组比较分析以及实时荧光定量表达分析筛选并鉴定到2个热激活特异性表达基因HbHSP17.6B和HbHSP17.6C，成功克隆出这2个基因的cDNA全长；通过巢式PCR方法，仅克隆出1个热激活启动子pHbHSP17.6C，对HbHSP17.6C基因启动子区和编码区序列片段进行整体克隆，证实了pHbHSP17.6C序列位于HbHSP17.6C基因起始密码子的上游，而HbHSP17.6C基因只有1个外显子。HbHSP17.6C属于小热休克蛋白，植物小热休克蛋白通常作为分子伴侣参与植物抗逆反应^[12]。在拟南芥的根和茎中，HbHSP17.6C的同源基因AtHSP17.6C应对热、冷、渗透胁迫、盐、干旱、遗传毒性、紫外线、氧化应激、伤害和病原体感染等胁迫时，都会有大量的激活表达^[13]。

20世纪很多物种还没有参考基因组，通过gDNA片段的质粒文库杂交及测序，在果蝇中克隆到热休克蛋白基因hsp70及其启动子序列^[14]。在烟草中应用该启动子驱动不同目的基因的表达，实现了通过调节温度来人为控制目的基因在植物中的表达，并产生不同表型^[15-16]。利用果蝇hsp70的启动子驱动Cre重组酶基因的表达，通过热激活Cre/loxp系统的重组反应，在转基因马铃薯中删除了筛选标记基因，但效率仅为4%^[17]；分别利用大豆和拟南芥的热休克蛋白基因的启动子pGmHSP17.6-L和pHSP18.2驱动Cre基因的表达，在转基因香蕉中删除标记基因的效率分别达到了60%和40%^[18]；在水稻中应用GmHSP17.5E基因的启动子驱动Cre基因的表达，删除标签基因的效率最高可达94%^[19]；在杨树中应用GmHSP17.5E基因的启动子分别驱动Cre/loxp和FLP/FRT系统，基因删除效率分别为63%和65%^[20]；使用玉米自身的热休克蛋白HSP70的启动子驱动Cre/loxp系统，基因删除效率最高可达100%^[21]。以上研究说明，虽然热休克蛋白基因的启动子功能具有一定的保守性，但是同一个启动子在不同物种中的通用性并不是特别高，应用物种自身的热休克蛋白基因的启动子可以增加基因工程技术的工作效率。

HbHSP17.6C基因具有热休克蛋白基因的典型特征：在热处理前不表达，只有热处理后才迅速启动表达。在橡胶树愈伤组织中，经过农杆菌浸染处理、各种培养条件变化，HbHSP17.6C基因均不激活表达，表明该基因的启动子在橡胶树愈伤组织中能够特异性响应热激活处理，对农杆菌介导的转基因过程不敏感，有望作为人为控制的分子开关在橡胶树及近源作物基因工程研究中发挥作用。

基金

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国家自然科学基金地区项目(32260402)
海南省自然科学基金面上项目(322MS026)
海南省崖州湾种子实验室“揭榜挂帅”项目(B21HJ0902)

参考文献

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文献

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排序方式：

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2025年第46卷第5期

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文章信息

doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.05.001

接收时间：2024-12-03
首发时间：2026-06-26
出版时间：2025-05-25

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作者

出版历史

收稿日期：2024-12-03
录用日期：2025-02-02

基金

国家自然科学基金地区项目(32260402)

海南省自然科学基金面上项目(322MS026)

海南省崖州湾种子实验室“揭榜挂帅”项目(B21HJ0902)

作者信息

^1.海南大学热带农林学院（农业农村学院、乡村振兴学院），海南海口　570228

^2.海南大学三亚南繁研究院，海南三亚　572025

通讯作者:

^* 张义（ZHANG Yi），E-mail：hudazhangyi@126.com。

参考文献

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/rdzwxb/CN/10.3969/j.issn.1000-2561.2025.05.001

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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