热带作物学报

香蕉MaERF15与MaACO8靶向结合调控果实采后成熟的分子机制

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黄冰云 ¹^,² , 郑云柯 ²^,³ , 张建斌 ²^,³ , 李新国 ¹^,^* , 刘菊华 ²^,³^,^*

热带作物学报 | 组学与生物技术 2025,46(5): 1032-1042

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热带作物学报 |组学与生物技术 2025 , 46 (5) : 1032 -1042

香蕉MaERF15与MaACO8靶向结合调控果实采后成熟的分子机制

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黄冰云¹^,², 郑云柯²^,³, 张建斌²^,³, 李新国¹^,^*, 刘菊华²^,³^,^*

作者信息

^1.海南大学热带农林学院，海南海口　570228

^2.热带作物生物育种全国重点实验室/中国热带农业科学院三亚研究院，海南三亚　572024

^3.中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口　571101

通讯作者:

^* 李新国（LI Xinguo），E-mail：lixinguo13@163.com;

刘菊华（LIU Juhua），E-mail：juhua69@126.com。

Molecular Mechanism of Banana MaERF15 Regulating Postharvest Fruit Ripening by Directly Binding MaACO8 Promoter

Bingyun HUANG¹^,², Yunke ZHENG²^,³, Jianbin ZHANG²^,³, Xinguo LI¹^,^*, Juhua LIU²^,³^,^*

Affiliations

^1.School of Tropical Agriculture and Forestry, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China

^2.National Key Laboratory for Tropical Crops Breeding / Sanya Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Sanya, Hainan 572024, China

^3.Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, Hainan 571101, China

出版时间: 2025-05-25 doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.05.002

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摘要

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香蕉是典型的呼吸跃变型果实。MaERF15是定位于细胞核且具有调控香蕉果实采后成熟作用的转录因子，MaACO8是在香蕉果实采后成熟过程中高水平表达的1个乙烯生物合成关键酶-ACC氧化酶基因，但MaERF15和MaACO8的分子互作机制尚未明确。探究乙烯响应因子MaERF15对下游乙烯合成关键基因的转录调控机制，为香蕉果实采后保鲜技术的创新提供理论依据。本研究从香蕉DNA中分离出MaACO8启动子序列，通过生物信息学分析、GUS染色等方法研究MaACO8的启动子活性；采用酵母单杂交技术、EMSA、双荧光素报告系统和活体成像系统研究MaERF15与MaACO8启动子互作机制。结果表明：MaACO8的启动子序列有11个，与AP2/ERF转录因子的结合元件GCC-box具有较强的启动活性；MaERF15能与MaACO8启动子的GCC-box特异性结合，激活MaACO8的表达，促进乙烯的生物合成进而调控果实成熟。本研究结果进一步完善了香蕉果实采后乙烯生物合成调控果实成熟的理论，为香蕉耐贮运育种和成熟调控新技术的研发分别提供基因资源和理论依据。

关键词

香蕉 / MaERF15 / MaACO8 / 转录调控

Abstract

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Banana is a typical respiration fruit. MaERF15 is a transcription factor located in the nucleus and has the effect of regulating postharvest ripening of banana fruits. MaACO8 is a key ethylene biosynthesis-ACC oxidase gene expressed at high levels during postharvest ripening of banana fruits. But the molecular interaction mechanism between the two has not been clarified. To explore the transcriptional regulation mechanism of ethylene response factor MaERF15 on the key genes of downstream ethylene synthesis was to provide a theoretical basis for the innovation of postharvest preservation technology of banana fruits. In this study, the promoter sequence of MaACO8 was isolated from banana DNA, and the promoter activity of MaACO8 was studied by bioinformatics analysis and GUS staining. Yeast monohybridization, EMSA, dual fluorescein reporter system and in vivo imaging system were used to study the interaction mechanism between MaERF15 and MaACO8 promoter. The results showed that there were 11 GCC-boxes in the promoter sequence of MaACO8 that bind to AP2/ERF transcription factors, which had strong priming activity. MaERF15 could specifically bind to the GCC-box of the MaACO8 promoter, activate the expression of MaACO8, promote the biosynthesis of ethylene, and regulate fruit ripening. The results further improved the theory of postharvest ethylene biosynthesis regulating fruit ripening of banana fruits, and would provide genetic resources and theoretical basis for the research and development of new technologies for storage and transportation tolerance breeding and maturity regulation of bananas, respectively.

Key words

banana / MaERF15 / MaACO8 / transcription regulation

引用本文

黄冰云, 郑云柯, 张建斌, 李新国, 刘菊华. 香蕉MaERF15与MaACO8靶向结合调控果实采后成熟的分子机制. 热带作物学报, 2025 , 46 (5) : 1032 -1042 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.05.002

Bingyun HUANG, Yunke ZHENG, Jianbin ZHANG, Xinguo LI, Juhua LIU. Molecular Mechanism of Banana MaERF15 Regulating Postharvest Fruit Ripening by Directly Binding MaACO8 Promoter[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2025 , 46 (5) : 1032 -1042 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.05.002

正文

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香蕉是全球产量最高的水果作物，也是全球水果贸易市场中重要的热带水果之一^[1]。香蕉果实是典型的呼吸跃变型果实，含有丰富的营养物质（如纤维、淀粉、多糖、维生素），对人体健康具有重要作用^[2-3]。香蕉作为全球贸易型的水果，在鲜果运输中保鲜技术显得尤为重要。随着生物技术的发展，研究果实品质形成与果实成熟机制有助于果实质量的提高和鲜果储存寿命的延长，促进果实保鲜技术的发展，减少全球鲜果产品的浪费^[4-5]。

乙烯响应因子（ethylene response factor，ERF）是AP2/ERF（apetala2/ethylene response factor）大家族中的1个亚族，最早从烟草中分离发现，含有1个AP2结构域，处于乙烯信号转导通路中的下游，调控着植物的生长、发育、成熟与衰老^[6]。AP2/ERF家族广泛参与植物生长和发育，包括组织分化和生殖器官的发育，还参与植物的生物和非生物胁迫反应^[7-10]。ERF作为乙烯信号通路的最终应答基因，在果实成熟中发挥着重要作用，在多种植物水果中发现其表达调控的研究，ERF通过结合下游ACO、ACS、PG、EXP、PSY等基因的启动子，直接调控果实成熟^[11-14]。ERF与果实品质形成相关基因启动子靶向结合，参与调控番茄（Solanum lycopersicum L.）、花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim.）、荔枝（Litchi chinensis Sonn.）等果实中胡萝卜素、花青素、酚类化合物等抗氧化物质的合成，影响果实品质的形成^[15-17]。ERF调控果实果皮软化和乙烯生物合成关键基因，参与果实成熟的调控。番茄中，SlERF.E4、RIN和SlASR1共同调控β-D-N-乙酰己糖酶（β-Hex）的表达，参与调控果实成熟^[18]。柿（Diospyros kaki Thunb.）的DkERF8、DkERF16和DkERF19通过激活DkXTH9启动子参与脱涩期间的果实软化^[19]；在猕猴桃（Actinidia chinensis Planch.）的研究中发现，AdERF9通过抑制AdXET5启动子的活性，影响猕猴桃果实的成熟^[20]。木瓜[Pseudocydonia sinensis（Dum.Cours.）C. K. Schneid.] CpERF9作为转录抑制因子，与CpPME1、CpPME2和CpPG5启动子中的GCC-box结合，调控木瓜果实的成熟^[21]。桃[Prunus persica（L.）Batsch] PpeERF2通过抑制2个ABA生物合成基因PpeNCED2、PpeNCED3以及细胞壁降解基因PpePG1的表达，调控木瓜果实的成熟^[22]。DkERF8和DkERF16分别增强了细胞修饰基因DkXTH11和DkXTH11的启动子活性，促进其转录表达。DkERF18增强了乙烯合成酶基因DkACS2启动子活性，促进了乙烯的生物合成和柿子果实的成熟^[23]。苹果（Malus domestica Borkh.）MdERF2抑制了乙烯合成关键基因MdACS1的转录表达，而MdERF3促进MdACS1的表达，MdERF2与MdERF3拮抗调节果实的成熟^[24]。PpERF4通过与PpACO1和PpIAA1基因的启动子结合促进其表达。ERF还与其他蛋白形成复合物，共同调控果实的成熟。PpERF4与PpIAA1结合形成复合物，促进脱落酸生物合成基因PpNCED2和PpNCED3以及果实软化基因PpPG1的表达，加速了桃子果实成熟，缩短了果实货架期^[25]。以上研究报道表明了ERF在果实成熟中的重要意义。在香蕉全基因组水平上重新鉴定香蕉A基因组中的AP2/ERF家族成员，研究其在香蕉果实采后成熟过程中的差异表达特性，发现AP2/ERFs家族共有317个家族成员，其中MaERF15在巴西蕉和粉蕉果实成熟过程中处于高表达水平，说明其可能在香蕉果实成熟中具有重要作用，可调控成熟相关基因的表达，从而影响果实采后成熟^[26]。前期从香蕉基因组中分离鉴定出MaERF15，并通过亚细胞定位，转录激活等实验，明确了MaERF15是定位于细胞核中具有转录激活活性的转录因子，但MaERF15参与乙烯生物合成调控果实成熟相关的研究还未见报道^[27]。

香蕉是典型的呼吸跃变型果实，伴随着呼吸跃变，内源乙烯生物合成量迅速上升并在短时间内达到高峰，所以内源乙烯的生物合成在果实采后成熟过程中发挥重要作用^[28]。香蕉果实内源乙烯生物合成过程分3个重要步骤：首先是在S-腺苷蛋氨酸合成酶（S-adenosyl-l- methionine synthase，SAMS）的作用下将蛋氨酸合成S-腺苷蛋氨酸；第二步是在氨基环丙烷羧酸合成酶（（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase，ACS）的作用下将S-腺苷蛋氨酸合成1-氨基环丙烷羧酸；最后在氨基环丙烷羧酸氧化酶（1-aminocyclopropane- 1-carboxylic acid oxidase，ACO）的作用下将1-氨基环丙烷羧酸氧化生成乙烯^[29]。在此过程中，ACO基因的表达与乙烯生物合成速率呈正相关，其基因活性可用于调控高等植物中乙烯的生物合成^[30]。1991年，首次成功地从甜瓜（Cucumis melo L.）果实组织cDNA中提取分离得到ACO基因序列并体外验证其活性^[31]。ACO是乙烯生物合成的关键酶基因，直接影响着乙烯的生物合成，在植物生长的各个时期发挥着重要作用，对植物生长、花朵衰落和果实成熟的研究中具有重要意义^[32]。ACO作为主要靶基因在基因工程中被TFs转录调控研究果实成熟。甜瓜CmPIF8抑制CmACO1启动子的活性，从而促进了乙烯的释放，加速了果实的成熟，间接增加了采后甜瓜果实中的蔗糖含量^[33]。在南果梨果实的PuACO家族研究中发现PuACO2、PuACO3和PuACO11在果实成熟和乙烯生物合成中起重要作用，可被乙烯诱导并被1-MCP处理抑制^[34]。ACO是一个重要的限速酶，其高表达直接影响乙烯的生物合成，形成一个正反馈调节机制，进一步促进果实的成熟^[35]。分析香蕉基因组发现有11个MaACO基因在果实成熟过程中表现出高表达水平，MaACO可能在果实成熟中具有重要的作用，但香蕉果实中乙烯响应因子MaERF15与关键酶基因ACO具体的调控机制还不清楚^[36]。

本研究选取MaACO8作为靶基因，研究其启动子的结构特征和启动活性，发现MaACO8启动子具有较强的活性，并受乙烯响应因子MaERF15的转录调控。本研究解析了MaERF15与MaACO8启动子互作调控果实成熟的分子机制，促进ERF家族在香蕉果实品质中的研究，为香蕉果实采后成熟或保鲜新技术的研发提供理论依据。

1　材料与方法

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1.1　材料

巴西蕉果实（Musa spp，Cavendish）采自中国热带农业科学院热带生物技术研究所文昌种植基地；本氏烟草（Nicotiana benthamiana）种子由本实验室提供；大肠杆菌DH5α感受态、农杆菌GV3101感受态和Y1H酵母感受态均购自上海唯地生物技术有限公司。

1.2　方法

1.2.1　 MaACO8启动子的分离扩增与生物信息学分析

（1）MaACO8启动子的分离扩增。根据香蕉A基因组数据库（http://banana-genome.cirad.fr/），从香蕉基因组DNA中分离出MaACO8启动子序列，设计MaACO8启动子序列引物，以巴西蕉DNA为模板扩增目的片段，并连接到pMD19-T载体中，将连接产物转化大肠杆菌感受态，进行PCR鉴定，挑选阳性菌株送测序，将测序正确的菌株扩大培养提取质粒，得到pMD19-T-MaACO8质粒。

（2）生物信息学分析。利用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在线网站对启动子元件进行生物信息学分析，使用TBtools软件制作启动子结构可视化图。

1.2.2　目的基因克隆及载体构建

（1）MaERF15的克隆及相关载体的构建。根据基因的cDNA序列设计特异性引物，以巴西蕉cDNA为模板扩增MaERF15全长，并连接到pMD19-T载体中，将连接产物转化大肠杆菌感受态，经PCR鉴定后，挑选阳性菌株送测序，将测序正确的菌株活化培养并提取质粒，得到pMD19-T-MaERF15质粒。分别在特异性引物两端添加无缝克隆接头序列，以pMD19-T-MaERF15质粒为模板，扩增目的片段，分别连接到pGreenⅡ62-SK和pGADT7载体中。扩增、回收、连接、转化鉴定并送测菌液。扩大培养测序正确的pGADT7-MaERF15和pGreen Ⅱ-62-SK-MaERF15菌液并抽提重组质粒。

（2）MaACO8启动子的克隆及相关载体的构建。根据MaACO8基因启动子序列设计包含MaERF15结合位点的特异性引物，以pMD19-T-MaACO8质粒为模板扩增启动子片段。将pBI121的35S启动子替换为MaACO8启动子，用Sda I和Xba I双酶切pBI121载体和启动子，将扩增片段MaACO8启动子连接到pBI121载体中。分别在特异性引物两端加无缝克隆接头序列，以pMD19-T-MaACO8为模板扩增目的片段，分别连接到pAbAi、pGreenⅡ0800-LUC表达载体中。将连接产物转化大肠杆菌感受态，经PCR鉴定后，挑选阳性菌株送测序，将测序正确的菌株活化培养提取质粒，得到pBI121-MaACO8、pAbAi-MaACO8和pGreenⅡ0800-LUC-MaACO8重组质粒。

1.2.3　 MaACO8启动子的活性检测

（1）转化农杆菌。将构建好的pBI121-MaACO8重组质粒转化农杆菌GV1301，具体转化步骤如下：从–80 ℃冰箱内取出GV3101农杆菌感受态细胞，迅速插入冰盒内，使其溶解。加入pBI121-MaACO8质粒轻轻混匀，依次于冰盒上静置5 min、液氮5 min（或干冰乙醇浴盒–80 ℃和–80 ℃冰冻）、37 ℃水浴5 min、冰浴5 min。添加700 μL不含抗生素的YEB液体培养基，混合均匀，于28 ℃震荡培养2~3 h。6000 r/min离心1 min，收集菌体，留取100 μL左右上清轻轻吹打重悬菌体并涂布于含相应抗生素的YEB平板上，倒置于28 ℃培养箱培养2~3 d。挑菌进行PCR鉴定，将阳性菌株放入50 mL的离心管中扩大培养备用。

（2）农杆菌介导法侵染香蕉果实切片。将农杆菌菌液在30 ℃的恒温摇床中震荡培养至OD₆₀₀=0.8，8000 r/min离心10 min，收集菌体，并用加入200 μmol/L乙酰丁香酮（AS）的MS液体培养基重悬至OD₆₀₀=0.6~0.8，室温暗处静置孵育2~3 h。将香蕉果实切成形状和厚度大致相同的薄片，于1.5%亚硫酸氢钠溶液中浸泡10 min。把香蕉薄片放入孵育好的菌液中，进行真空辅助侵染。将侵染后的香蕉薄片均匀放置于1/2MS固体培养基上28 ℃暗培养3 d，每组重复3次。

（3）GUS染色实验。选取侵染后大小相近的香蕉果实薄片置于50 mL小烧杯中放于GUS染液中进行染色处理过夜，每组重复3次，具体操作步骤按照试剂盒说明书，把染色处理后的果片用75%乙醇进行脱色，直到脱色液透明，将果片体置于体视显微镜下观察拍照。切去35S启动子的空载体为阴性对照，正常pBI121载体为阳性对照。

（4）GUS酶活性检测。将侵染后的香蕉薄片样品放入研钵中，加入液氮研磨，然后取200 mg样品放入1.5 mL离心管中，加入1800 μL PBS，涡旋30 s后，在冰上静置10 min，接着12 000 r/min离心10 min，离心后收集的上清液为GUS酶活的测定样品。具体检测方法参考植物β-葡萄糖苷酸酶（GUS）ELISA试剂盒（mlbio酶联生物，中国）说明书。

1.2.4　酵母单杂交（YIH）

（1）AbA的背景筛选。①转化Y1H Gold酵母感受态：将构建好的pAbAi-MaACO8和pAbAi-p53i质粒用BstbI单酶切，65 ℃酶切1 h，电泳泡胶检测正确后，纯化回收目的片段，转化Y1HGold酵母感受态细胞（转化步骤参照Y1H酵母感受态转化说明书）。观察菌落生长情况，并挑选出长势较好的菌落，PCR鉴定pAbAi-MaACO8整合到Y1HGold基因组中的情况。将检测正确的阳性菌株保存（–80 ℃甘油保存），此酵母菌株为Y1HGold（pAbAi-MaACO8）阳性菌株。②AbA背景表达水平筛选：挑取固体培养基中Y1Hgold（pAbAi-MaACO8）阳性单克隆，用100 µL 0.9% NaCl溶液吸打混匀，测定其吸光度，根据比例稀释菌液至OD₆₀₀=0.002。吸取100 µL混合液均匀涂布于含有不同浓度AbA抗生素的SD/-Ura固体培养基上，设置AbA浓度每50 ng为1个梯度，设置范围为0~1000 ng/mL。30 ℃倒置培养48~72 h。观察不同AbA浓度下SD/-Ura板中单菌落的生长情况，若到某一个浓度酵母菌无法生长，则在该浓度范围内进行细致筛选，最终筛选AbA表达水平为酵母无法生长的最低浓度。

（2）酵母转化。①Y1H Gold（pAbAi-MaACO8）酵母感受态制备：在SD/-Ura板上挑取3~5个Y1Hgold（pAbAi-MaACO8）阳性菌于3 mL YPDA培养基中，在30 ℃摇床中200 r/min活化培养8~12 h；选取活性强的菌液，吸取5 μL加入到50 mL的YPDA培养基中在250 mL的锥形瓶继续培养孵育，16~20 h至OD₆₀₀=0.15~0.3；将菌液收集于50 mL离心管中，7000 r/min离心5 min，弃上清液，加入50 mL的YPDA重悬，于250 mL的锥形瓶培养3~5 h，使得OD₆₀₀=0.4~0.5；收集菌体7000 r/min离心5 min，弃上清，加入30 mL ddH₂O重悬，7000 r/min离心5 min，弃上清液，将沉淀重悬于1.5 mL的1.1×TE/LiAC；细胞悬液转移至1.5 mL离心管中，12 000 r/min离心50 s，弃上清液，向管中沉淀加入600 μL 1.1×TE/LiAC，酵母Bait-MaACO8感受态制备完成（保存于冰上，2 h内转化）。②Y1HGold（pBait）酵母感受态与Prey表达载体互作验证：取上述50 μL Y1Hgold（pAbAi-MaACO8）酵母感受态细胞放入2个1.5 mL离心管中，向管中分别加入100 ng Prey表达载体pGADT7-MaERF15和pGADT7，具体转化步骤参照1.2.4（1）中的转化方法，吸取100 μL转化菌液涂布于SD/-Leu板上，培养3~5 d。待菌落长出后，挑取单菌落溶于1 mL 0.9% NaCl溶液，将OD₆₀₀调至0.2，点涂于SD/-Leu和SD/-Leu+AbA固体培养基上，观察每组酵母菌的生长情况，从而确定互作情况。

1.2.5　凝胶阻滞实验（EMSA）

将MaERF15基因的编码序列克隆到pGEX-4T-1载体（Amersham Biosciences，USA）上，获得带GST（glutathione S-transferases）标签的重组蛋白，将重组蛋白转化Escherichia coli菌株BM Rosetta（DE3），得到的蛋白用Glutathione-Superflow Resin（Clontech）进行纯化。MaACO8启动子与MaERF15的结合顺式作用元件的探针序列（5-ATGGCCGACATGC-3）由上海生工合成，其5'端用生物素标记。EMSA具体操作步骤参照XIAO等^[37]的方法。

1.2.6　双荧光素酶报告系统试验

（1）转化农杆菌GV3101。参照上述1.2.2转化农杆菌GV1301的方法，将构建好的pGreenⅡ0800-LUC-MaACO8和pGreenⅡ-62-SK-MaERF15质粒分别转化农杆菌感受态GV3101（pSoup）。pGreenⅡ0800-LUC和pGreenⅡ62-SK空载体转化为对照。

（2）烟草转化和瞬时表达。将实验组（GV3101/pGreenⅡ-LUC-MaACO8和GV3101/pGreenⅡ-62-SK-MaERF15）与对照组（GV3101/pGreenⅡ0800-LUC-MaACO8和GV3101/pGreenⅡ-62-SK）分别置于YEP液体培养基（25 μg/mL Rif、50 μg/mL Kan和20 μg/mL Tet）中，30 ℃，220 r/min活化扩大培养至OD₆₀₀=0.8，5000 r/min离心10 min，收集菌体。将菌体用侵染液重悬至OD₆₀₀=0.6，室温静置2 h。将GV3101/pGreenⅡ-LUC-MaACO8分别与GV3101/pGreenⅡ-62-SK和GV3101/pGreenⅡ-62-SK-MaERF15以1∶3的体积比混匀。用去掉针头的1 mL注射器将混合好的菌液从烟草叶背面进行注射。为保证实验背景的一致性，需要将对照载体和实验目标载体的菌液注射在同一叶片的不同部位上。室温条件下培养2 d，每天向叶片喷水1~2次，保持湿润。

（3）双荧光素酶报告基因活性检测。取注射后的实验组和对照组烟草叶片分别放入研钵中研磨，参照FU等^[21]的方法测定萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性值，最后统计分析实验组和对照组的萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值（LUC/REN）。

（4）活体植物发光成像观察。将1.2.6（1）中的菌液1∶3混匀组成4种组合，在同一片叶片中分为4个区域分别注射4种组合的菌液分为对照组和实验组。48 h后用活体植物发光成像系统进行拍照观察，观察前需要于暗处在烟草叶片上喷洒反应底物D-虫荧光素钾盐溶液反应5 min。

1.3　数据处理

使用Excel、GraphPadPrism 9.5、TBtools、IBM SPSS Statistics 25软件对数据进行统计和分析。

2　结果与分析

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2.1　 MaACO8启动子的克隆和生物信息学分析

根据香蕉A基因组数据库（http://bananagenome.cirad.fr/）BLAST，从香蕉基因组DNA中分离出2000 bp的MaACO8启动子序列，采用PlantCARE软件对MaACO8启动子进行生物信息学分析。结果表明，MaACO8启动子包含11处与ERF结合的GCC-box核心启动子元件、36个CAAT-box、14个负责启动、促进和增强转录的TATA-box等（图1）。

2.2　 MaACO8启动子活性检测

将MaACO8启动子取代pBI121载体的35S启动子（图2A），利用农杆菌介导法转化侵染香蕉果实切片。pBI121作为阳性对照，去除35S启动子的pBI121作为阴性对照进行GUS染色。染色结果显示，使用MaACO8启动子侵染的香蕉薄片颜色比阴性对照蓝，但比阳性对照稍浅（图2B）。其GUS活性（图2C）与染色结果一致，表明MaACO8启动子具有较强的启动活性。

2.3　MaERF15与MaACO8启动子的互作机制

2.3.1　pAbAi-MaACO8载体转化酵母

为了验证MaERF15是否与MaACO8启动子存在互作关系，分别将MaERF15和MaACO8启动子构建到pGADT7和pAbAi载体中，得到pGADT7-Ma ERF15和pAbAi-MaACO8重组载体进行酵母单杂交实验（图3A）。将构建好的Bait载体pAbAi-MaACO8和pAbAi-p53i质粒用BstbⅠ单酶切反应后回收。将酶切产物转化到酵母Y1HGold感受态中，取100 μL转化产物涂布于SD/-Ura培养基上，30 ℃倒置培养48~96 h，挑取单菌落进行PCR鉴定，检测pBait-AbAi是否整合到酵母菌株中（pAbAi-p53i为阳性对照）。结果表明pAbAi-MaACO8载体成功整合到酵母基因组中，诱饵载体转化成功。

2.3.2　AbA背景筛选

金担子素A（aureobasidin A，AbA）是环酯肽类抗生素中的一种，其浓度为0.1~0.5 μg/mL时能抑制酵母菌株生长。以pAbAip53i为对照检验金担子素的背景表达，其酵母菌株的生长浓度范围是0~200 ng/mL。结果表明，抑制pAbAi-MaACO8酵母菌株生长的最低AbA浓度为50 ng/mL。

2.3.3　酵母单杂交

将转入pAbAi-MaACO8诱饵载体的酵母菌制作成Y1HGold（pBait）酵母感受态后与MaERF15构建的Prey表达载体共转化后观察酵母细胞的生长情况。如图3B所示，酵母细胞在不含有抗生素AbA的SD/-Leu培养基上生长良好。培养基内加入抗生素50 ng/mL的AbA后，实验组（AD-MaERF15+MaACO8-promoter）的酵母细胞可以正常生长；而阴性对照组（AD-Empty+MaACO8-promoter）共转化的酵母细胞则不能生长，表明MaERF15与MaACO8启动子互作。

2.3.4　凝胶阻滞实验（EMSA）

生物信息学分析结果表明MaACO8的启动子有MaERF15的结合元件GCC-box，因此采用EMSA技术来验证MaERF15是否能与MaACO8的启动子直接结合。如图3C所示，MaERF15转录因子能与MaACO8的启动子上的GCC-box直接结合，随着竞争性的冷探针的加入显著降低了MaERF15与MaACO8启动子的结合能力，加入非标记的突变探针并未影响MaERF15与MaACO8的结合能力，非标记的突变探针则不能与MaERF15结合。以上结果表明MaERF15转录因子能特异性地与MaACO8的启动子上的GCC-box直接结合。

2.4　MaERF15对MaACO8的转录调控作用

分别将MaERF15和MaACO8构建到pGreen Ⅱ62-SK和pGreenⅡ0800-LUC载体中，得到pGreenⅡ-62-SK-MaERF15和pGreenⅡ0800-LUC-MaACO8重组载体（图4A）。转化农杆菌侵染烟草叶片，用双荧光素酶报告基因检测试剂盒对荧光素酶活性进行检测，验证MaERF15与MaACO8的启动子的互作能力。将报告载体与效应载体共侵染烟草叶片，将MaACO8启动子加空效应载体作为对照组，其LUC/REN比值作为1。结果显示，MaERF15与MaACO8启动子共侵染烟草叶片LUC活性显著高于对照组（图4B）。同样地，在活体植物发光成像系统下荧光强弱也直观显示出MaERF15与MaACO8启动子的荧光素酶活性明显高于对照组（图4C），这充分说明MaERF15对MaACO8的转录具有激活作用。

3　讨论

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香蕉采后成熟决定了水果的保质期，乙烯生物合成是决定香蕉成熟的核心因素^[38]。ACO（1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶）是植物乙烯合成途径中的关键酶，对植物的开花、果实成熟和种子发育等生物学过程有重要影响，参与调控植物的成熟和衰老过程^[39]。2003年，RASORI等^[40]构建β-葡萄糖醛酸酶（GUS）报告基因与桃ACO基因启动子之间的嵌合融合体，转化番茄植株，并在桃果实中进行瞬时活性鉴定，分析ACO启动子的功能。本研究通过将MaACO8启动子构建到具有β-葡萄糖醛酸酶（GUS）报告基因的pBI121载体中，使用农杆菌介导法转化到香蕉果片中，通过染色观察GUS基因的瞬时表达情况和定量分析GUS酶活性，从而确定启动子活性的强弱，研究结果表明MaACO8启动子具有较强的启动子活性。

ERF是AP2/ERF超家族的一个亚家族，广泛参与调控果实品质的形成，是植物生长过程中重要的转录因子^[41]。ERFs作为激活子或抑制子调控果实品质形成相关基因的表达，参与果实成熟的调控。ERFs可以直接或间接调控乙烯生物合成中的关键酶基因ACS和ACO，直接影响果实中乙烯的生物合成，进而影响成熟过程^[42]。MdERF4直接与MdACS1启动子结合并抑制其表达，并与MdERF3启动子结合，抑制MdERF3对MdACS1启动子的激活作用，间接抑制了乙烯的合成，延长了果实的贮藏期^[43]。WANG等^[36]从香蕉A基因组中鉴定到11个与果实成熟密切相关的ACO基因，其中MaACO8在巴西蕉和粉蕉果实采后成熟过程中高水平表达，这与MaERF15在采后果实中的表达具有相似的趋势，二者互作在调控香蕉果实采后乙烯生物合成和果实成熟过程中具有重要作用。本研究中的MaERF15是乙烯响应因子，生物信息学分析结果表明MaACO8启动子区域有多个ERF转录因子结合域，酵母单杂交实验证明二者存在互作关系，EMSA证明MaERF15与MaACO8基因启动子的GCC-box直接结合，并通过双荧光素酶报告系统和活体荧光成像系统证实了MaERF15对MaACO8的转录调控作用，进而调控乙烯的生物合成，影响香蕉的成熟过程。这与香蕉B基因家族中MbERF71、MbERF113可分别靶向MbACO2启动子的GCC-box，激活MbACO2的表达结果一致^[44]。MaERF11转录因子募集组蛋白脱乙酰酶MaHDA1并与MaACO1启动子相互作用以抑制其表达，而MaERF9则激活MaACO1启动子活性^[45]。这表明乙烯合成关键酶基因ACO受到多个ERF家族成员的复杂调控。ERF参与果实成熟调控的网络错综复杂，本研究解释了ERF通过转录调控乙烯生物合成关键基因ACO参与果实成熟的调控机制。

4　结论

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本研究揭示了香蕉中乙烯响应因子MaERF15与乙烯生物合成关键基因MaACO8相互作用参与果实成熟的调控机制。MaERF15与MaACO8启动子中的GCC-box靶向结合，激活MaACO8的表达，从而促进果实中乙烯的生物合成，加快果实成熟的进程。本研究促进了ERF转录因子调控下游乙烯生物合成关键基因的研究，进一步解析ERF在采后果实成熟中的调控网络，为种质资源改良和果实保鲜技术的创新提供理论基础。

基金

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国家自然科学基金面上项目(32172269)
国家香蕉产业技术体系建设专项(CARS-31)

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文献

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2025年第46卷第5期

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文章信息

doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.05.002

接收时间：2024-12-03
首发时间：2026-06-26
出版时间：2025-05-25

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作者

出版历史

收稿日期：2024-12-03
录用日期：2024-12-28

基金

国家自然科学基金面上项目(32172269)

国家香蕉产业技术体系建设专项(CARS-31)

作者信息

^1.海南大学热带农林学院，海南海口　570228

^2.热带作物生物育种全国重点实验室/中国热带农业科学院三亚研究院，海南三亚　572024

^3.中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口　571101

通讯作者:

^* 李新国（LI Xinguo），E-mail：lixinguo13@163.com;

刘菊华（LIU Juhua），E-mail：juhua69@126.com。

参考文献

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/rdzwxb/CN/10.3969/j.issn.1000-2561.2025.05.002

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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