热带作物学报

DAP-seq和RNA-seq揭示转录因子APETALA3-3调控铁皮石斛花型变化机理

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宋雅蓉 , 朱洪凤 , 敖叠 , 刘安祺 , 陆德银 , 和凤美 ^*

热带作物学报 | 组学与生物技术 2025,46(5): 1052-1063

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热带作物学报 |组学与生物技术 2025 , 46 (5) : 1052 -1063

DAP-seq和RNA-seq揭示转录因子APETALA3-3调控铁皮石斛花型变化机理

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宋雅蓉（2000—），女，硕士研究生，研究方向：花卉植物分子遗传育种。

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宋雅蓉, 朱洪凤, 敖叠, 刘安祺, 陆德银, 和凤美^*

作者信息

云南农业大学园林园艺学院，云南昆明　650201

通讯作者:

^* 和凤美（HE Fengmei），E-mail：hefengmei918@126.com。

Mechanism of Transcription Factor APETALA3-3 Regulating Floral Morphogenesis in Dendrobium officinale Based on DAP-Seq and RNA-seq Analysis

Yarong SONG, Hongfeng ZHU, Die AO, Anqi LIU, Deyin LU, Fengmei HE^*

Affiliations

College of Horticulture and Landscape, Yunnan Agricultural University, Kunming, Yunnan 650201, China

出版时间: 2025-05-25 doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.05.004

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摘要

收起

兰花唇瓣是特化的花瓣，因其多样性具有极大观赏价值和生物学价值，但其形成机理迄今仍未解决。APETALA3-3（AP3-3）是花器官身份基因，与兰花唇瓣形成有关，但其如何调控兰花唇瓣多样性形成机理目前未见报道。本研究以铁皮石斛野生型植株和铁皮石斛DoAP3-3过表达植株的花器官为研究对象，通过DAP-seq和RNA-seq联合分析，从铁皮石斛转录因子DoAP3-3调控下游靶基因的角度探讨唇瓣多样性形成机制。结果表明：共鉴定出MADS6、NAC029、NAC054、WOX3、AS2、ERECTA、AG等7个关键候选靶基因，这些靶基因可能通过特异性调控或在DoAP3-3的作用下与其他基因互作调控花器官发育和花型发育。酵母单杂交实验验证表明转录因子DoAP3-3与MADS6之间存在相互作用，影响花型发育。该研究为初步解析花器官特征基因DoAP3-3与其靶基因之间的调控机制，探究兰科植物中高度特化和多样化的花形态形成机理奠定基础。

关键词

APETALA3-3 / 铁皮石斛 / DNA亲和纯化测序 / DAP-seq / 转录组测序 / 花型发育

Abstract

收起

The diversity of orchid labellum, a specialized petal, has great ornamental and biological value, but the formation mechanism has not been solved so far. APETALA3-3 (AP3-3) is a floral organ identity gene, which is related to the formation of orchid labellum, but there is no report on how it regulating the formation mechanism of orchid labellum diversity. In this project, wild type and DoAP3-3 overexpressing floral organs of Dendrobium officinale were used as the research objects to explore the formation mechanism from the perspective of transcription factor DoAP3-3 regulating downstream target genes through DAP-seq and RNA-seq joint analysis. The results showed that a total of 7 key candidate target genes, MADS6, NAC029, NAC054, WOX3, AS2, ERECTA, AG were identified, which may regulate floral organ development and floral morphogenesis development under the action of DoAP3-3 by specific regulation or interaction with other genes. The interaction between transcription factor DoAP3-3 and MADS6 was verified by yeast one-hybrid experiment, which further affecting floral morphogenesis development. This study would lay a foundation for preliminary analysis of the regulatory mechanism between DoAP3-3 and its target genes, and exploring the formation mechanism of highly specialized and diversified flower morphology in Orchidaceae.

Key words

APETALA3-3 / Dendrobium officinale / DNA affinity purification sequencing / DAP-seq / RNA-seq / flower morphologies development

引用本文

宋雅蓉, 朱洪凤, 敖叠, 刘安祺, 陆德银, 和凤美. DAP-seq和RNA-seq揭示转录因子APETALA3-3调控铁皮石斛花型变化机理. 热带作物学报, 2025 , 46 (5) : 1052 -1063 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.05.004

Yarong SONG, Hongfeng ZHU, Die AO, Anqi LIU, Deyin LU, Fengmei HE. Mechanism of Transcription Factor APETALA3-3 Regulating Floral Morphogenesis in Dendrobium officinale Based on DAP-Seq and RNA-seq Analysis[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2025 , 46 (5) : 1052 -1063 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.05.004

正文

收起

石斛属（Dendrobium Sw.）是兰科最大属之一，兼具观赏价值和药用价值，也是四大观赏兰花属之一。目前学者们已掌握了铁皮石斛（Dendrobium officinale）瓶内开花技术及遗传转化技术，可在分子层面对其花器官特异性进行研究，因此铁皮石斛是研究花器官发育的极好模型。

已有研究表明MADS-box基因作为植物花器官的发生发育与形态构造的关键转录因子，可通过复杂的网络在花器官发育不同阶段形成复杂复合物来调控花器官的发育，因而成为花器官研究最广泛的基因家族^[1-2]。经典的“ABC”模型在模式植物拟南芥和金鱼草花器官突变体的研究中被提出^[3-4]，随着矮牵牛和拟南芥中D类基因^[5-6]及E类基因^[7-8]的发现和鉴定，进一步将花发育模型扩展到“ABCDE”模型，即A+E共同控制萼片的形成，A+B+E共同控制花瓣的形成，B+C+E调控雄蕊的形成，C+E调控心皮的形成，D+E调控胚珠的形成。除“ABCDE模型”^[9]外，“兰花编码”^[10-11]、“Homeotic Orchid Tepal”模型^[12]和“花被（P）编码”^[13]模型被广泛认为是解释兰花花被器官身份特征的假说。

APETALA3-3（AP3-3）是MADS-box基因家族中B类基因^[14-15]。有研究表明在耧斗菜和黑种草中沉默AP3-3基因，仅导致其花瓣向萼片的同源异型转变^[16]，已有研究鉴定和预测了毛茛科多个物种中花瓣特征基因AP3-3的下游靶基因^[17]。兰科植物的唇瓣是特化的花瓣，是兰科植物独有的特异性器官，也是兰科植物的主要观赏器官和昆虫传粉器官，而AP3-3已被证明是兰花唇瓣发育的主要转录因子，但目前AP3-3在兰科植物中的研究较少。因此研究AP3-3在兰花中参与唇瓣多样性形成的差异表达调控机理，不仅能揭示唇瓣的起源与进化等机制，还为遗传操作改变花型、培育兰花新品种和兰花的保育等方面奠定基础，在观赏园艺和资源保护等领域具有更加广阔的应用前景。

DNA亲和纯化测序（DNA affinity purification sequencing，DAP-seq）分析作为目前新开发的一种体外检测TF-DNA（transcription factor，TF）互作的分析方法，成功将体内结合实验转移到体外，极大地提高了DNA结合位点发现的效率，可以高通量精确定位植物体内基因组中转录因子的结合位点^[18-20]。转录组测序（RNA-seq）技术被用于研究基因表达、调控和育种新基因的挖掘^[21-22]。利用转录组与DAP-seq共同研究转录因子-靶基因的调控网络关系，鉴定铁皮石斛转录因子DoAP3-3下游靶基因，能够精准地挖掘出对表型具有显著贡献的核心基因。

1　材料与方法

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1.1　材料

铁皮石斛野生型植株（WT）和铁皮石斛DoAP3-3过表达植株（OE）来自于本实验室前期研究。铁皮石斛新鲜叶片采自云南省林业和草原科学院石斛种植基地。

1.2　方法

1.2.1　DNA亲和纯化测序

提取铁皮石斛叶片DNA，并将其片段化，用磁珠筛选目标片段后利用建库试剂盒（NEXTflex Rapid DNA-Seq Ki）构建文库；构建转录因子DoAP3-3的halo-tag体外表达质粒，利用麦胚系统进行蛋白表达。将纯化后的转录因子DoAP3-3和亲和标签融合蛋白与基因组DNA文库共同孵育，用Halo Tag特异性磁珠，将目的蛋白和DNA复合物进行提取和纯化，进行PCR扩增，用Qubit^TM dsDNA-HS Assay Kit检测DNA文库质量，测序由武汉爱基百客生物科技有限公司完成。

1.2.2　DAP-seq测序数据分析

使用Fastqc（version: 0.11.5）软件对原始数据质控处理，使用Trimmomatic（version: 0.36）软件进行数据过滤，使用BWA（version: 0.7.15-r1140）软件将clean reads数据比对到Dendrobium catenatum（GCF_001605985.2）参考基因组上，利用MACS（version: 2.1.1.20160309）软件在基因组范围内检测转录因子DoAP3-3相对于对照所富集的峰，筛选显著性富集的峰，筛选阈值为q value<0.001且Fold Change大于2。对peak关联的基因进行GO及KEGG分析。利用Homer、MEME、MEME-ChIP软件分析转录因子DoAP3-3靶标基因富集motif。利用IGV软件对结合峰进行可视化分析，红色峰为重复1，蓝色峰为重复2，绿色峰为阴性对照（input）。每个基因的外显子-内含子结构和方向（箭头）显示在面板的底部。红色箭头表示靶基因TSS上下2000 bp范围内结合情况。[0-50]代表结合的强度，通过峰的高度来反映。

1.2.3　转录组测序

对铁皮石斛野生型植株（WT）和铁皮石斛DoAP3-3过表达植株（OE）分别提取不同时期（从花芽到完全开放）混合样花蕾RNA，利用Illumina高通量测序平台进行RNA测序，测序由北京擎科生物科技股份有限公司完成。

1.2.4　转录组测序数据分析

使用Fastqc对测序得到的raw data进行过滤，利用Hisat将过滤得到的clean reads与参考基因组Dendrobium catenatum（GCF_001605985.2）进行序列比对。用DEGseq软件对铁皮石斛DoAP3-3过表达植株和WT植株测序结果进行基因表达量差异分析，以Fold Change≥2且FDR<0.01筛选差异表达基因。将获得的差异基因与NR、eggNOG、GO、KEGG、Swissprot和Pfam等六大公共数据库进行比对，获得在各数据库的注释信息，筛选花器官发育相关差异表达基因。

1.2.5　启动子顺式作用元件生物信息学分析

利用植物顺式元件数据库Plant CARE对关键候选靶基因启动子序列的顺式作用元件进行预测分析，用TBtools软件进行可视化分析。

1.2.6　酵母单杂交互作实验

以铁皮石斛DoAP3-3过表达植株的cDNA为模板，扩增DoAP3-3编码序列，连接到pGADT7载体（Clontech，USA）中，得到pGADT7-DoAP3-3，作为猎物。以铁皮石斛MADS6基因DNA为模板，扩增目的基因启动子的特异性DNA序列，克隆到pHIS2载体（Clontech，USA）中，得到pHIS2-MADS6，作为诱饵。将构建到pHIS2载体上的MADS6基因及构建到pGADT7的DoAP3-3基因，通过共转的方法转化至酵母菌株Y187。分别从转化反应的平板上随机挑取3个单菌落，OD₆₀₀=0.002，稀释（10⁰、10^-1、10^-2）点板至对应的不添加histidine，但添加不同浓度（0、2.5、5、10、20、30、40、50、75、100 mmol/L）HIS3蛋白竞争性抑制剂3-AT（3-amino-1,2,4- triazole）的缺陷型平板上，30 ℃恒温培养3 d，筛选合适浓度，消除自激活现象。将实验组（pHIS2-MADS6+pGADT7-DoAP3-3）、阴性对照组（pHIS2-MADS6+pGADT7）、阳性对照组（pGAD53m+pHIS2-p53）验证成功的单菌落，用2 mL的ddH₂O水重悬，OD₆₀₀=0.002，浓度设置为3个梯度10⁰、10^-1、10^-2，吸取10 μL分别点板到SD-TL（-trp，-leu）、SD-TLH（-trp，-leu，-his）、SD-TLH+40 mmol/L 3AT培养基上（参照Clontech公司的PT3024-1/Yeast Protocols Handbook），每个板点3个点，30 ℃恒温培养3~5 d。

2　结果与分析

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2.1　铁皮石斛野生型植株和DoAP3-3过表达植株花器官形态比较分析

铁皮石斛野生型植株和DoAP3-3过表达植株花型差异如图1所示，其花型差异只表现在花瓣和萼片分布以及唇瓣的大小和颜色上，其他形态无明显变化。过表达花朵的2片花瓣逆时针旋转大于90°，与萼片几乎重叠，花瓣和萼片或镶嵌或融合；过表达花朵的唇瓣较大，且唇瓣腹部近轴凸起消失较为平展，远轴处紫色斑点消失。

2.2　DAP-seq测序数据结果分析

提取铁皮石斛叶片DNA进行DAP-Seq测序，获得DAP-seq原始数据。将铁皮石斛clean reads数据比对到Dendrobium catenatum（GCF_001605985.2）基因组序列，比对率达99.72%，并得到转录因子DoAP3-3结合的peaks。对所有转录因子结合的peaks进行汇总和分类，在基因组范围内共获得175 468个peaks，平均peaks长度为399.43 bp，对peaks各功能元件分布个数进行统计，其中6579个peaks位于启动子区域上，占peaks总数的3.75%（图2），有56.85%位于基因间区，3.75%峰位于启动子区域，5′-非翻译区和3′-非翻译区分布最少（图3A）。位于启动子区域上的peaks有90.74%的峰都结合到启动子上（图3B）。这表明DoAP3-3是具有DNA结合能力和基因调控活性的转录因子。

2.3　DAP-seq鉴定转录因子DoAP3-3结合花发育下游潜在靶标基因分析

在启动子范围内共筛选出5768个潜在结合靶基因，对应6579个peaks，其中与花器官及花型发育相关的潜在靶基因共82个，对应94个peaks。这些潜在结合靶基因包括转录因子家族基因和功能性蛋白基因，如MYB-related、MADS-MIKC、AP2/ERF-ERF、B3、B3-ARF、C2C2-YABBY、HB-BELL、MADS-M-type、NAC等转录因子家族基因（图4）；TAA1、DCR、ERECTA等功能性蛋白基因。

对DAP-seq检测到的与花发育相关的基因进行功能注释，筛选P<0.05前30条途径进行富集分析，结果显示，铁皮石斛富集GO条目主要是生物过程，包括繁殖结构发育、花器官发育、花轮发育等生物过程（图5）。

2.4　转录组测序分析

对铁皮石斛野生型植株和DoAP3-3过表达植株分别提取生殖生长期花蕾RNA，利用Illumina高通量测序平台进行RNA测序，共产出15.88 Gb数据，Q30碱基百分比在95.98%及以上。分别将各样品的clean reads与参考基因组进行序列比对，比对效率为87.82%~91.43%。

2.5　转录组测序分析鉴定转录因子DoAP3-3调控花发育相关差异表达基因

为了鉴定在铁皮石斛中受DoAP3-3转录调控的基因，本研究通过转录组测序对铁皮石斛野生型植株（WT）和DoAP3-3过表达（OE）植株花蕾进行比较转录组分析，共发现8101个差异表达基因，其中3845个基因下调表达、4256个基因上调表达（图6A）。进一步对这些差异表达基因进行筛选，发现86个与花发育相关的差异表达基因，其中32个基因上调差异表达，54个基因下调差异表达（图6B）。AS2、MADS16、NAC054、DL、LFL1、GI等基因在过表达植株中的表达量较低，均低于野生型植株。WOX3、FT、FZP、GATA22、ENDO2等基因在过表达植株中的表达量较高，均高于野生型植株。

2.6　DAP-seq结合RNA-seq分析转录因子DoAP3-3调控花器官及花型发育的潜在直接靶基因

将DAP-seq中鉴定到的与花发育相关的82个靶标基因与过表达植株和野生型植株RNA-seq分析中的85个DEGs进行比较，发现30个共同的基因（图7A）。在DoAP3-3过表达植株中有19个基因为正向调控的靶标基因，11个为负向调控的靶标基因（图7B）。这些靶标基因按照功能分类可分为3类：第一类与花发育阶段中的成花诱导有关，其中NAC035、FT、LFL1、LHY、ZHD4、ZTL、AOD3、RVE8参与调控开花时间；第二类与花器官原基形成即花器官发育有关，其中MADS6影响花分生组织决定性花器官发育、花器官形成及花轮形态发生，FZP、BAM1决定花分生组织身份，指定花器官身份，AG、CYP40参与花早期发育过程中器官身份的控制，在维持花分生组织的决定性中发挥作用，DL决定心皮身份和花分生组织，ATH1控制花器官与茎之间的边界形成，影响花器官脱落，TAA1、FHA2影响花器官、雄蕊发育，LUG调节花器官的发育，JMJ706参与花形态发生；第三类参与花发育阶段花器官发育成熟即花型发育，其中NAC054、NAC029影响花朵发育，WOX3参与萼片形成，AS2影响花瓣发育，ERECTA调控花形态和花序结构，DCR影响毛状体形态发生。在DoAP3-3过表达植株中WOX3、NAC029、MADS6、ERECTA、AG表达量均高于野生型，AS2、NAC054的表达量较低（图8，图9），结合过表达植株花型表型变化与其基因功能，这些基因极有可能是转录因子DoAP3-3的关键下游靶基因。

2.7　转录因子DoAP3-3调控花型关键候选靶基因分析

本研究从鉴定出的直接靶标基因中挑选出7个与花型发育密切相关的靶基因MADS6、NAC029、NAC054、WOX3、AS2、ERECTA、AG作为关键候选靶基因。对这7个靶基因进行顺式作用元件分析，结果显示，除了含有多个转录起始核心元件TATA-box和CAAT-box外，这7个基因启动区域分布的顺式作用元件与植物激素反应、光反应、植物生长发育、生物和非生物胁迫反应有关（图10）。

为了更深入地了解DoAP3-3的DNA结合特性，本研究使用MEME和MEME-CHIP软件对7个候选靶基因的启动子与peak重叠序列分别进行motif分析和motif富集分析。motif分析发现，除AG外其余靶基因均能与motif1、motif2、motif3结合（图11）。motif富集分析显示，富集到BASIC PENTACYSTEINE（BPC）TFs的结合基序的GA/CT-rich（图12）。

为了进一步验证DoAP3-3调控花型发育的直接作用，本研究选择在DAP-seq分析中启动子区域显示出富集结合位点（图9，图11）的MADS6基因作进一步验证，通过酵母单杂交实验验证DoAP3-3与其之间是否存在相互作用以调控花型变化。由图13可知，阳性对照（pGAD53m+pHIS2-p53）在SD-TL、SD-TLH、SD-TLH+40 mmol/L 3AT平板上均能正常生长；阴性对照组（pHIS2-MADS6+pGADT7）在SD-TL、SD-TLH平板上能正常生长，在SD-TLH+40 mmol/L 3AT平板上不生长；实验组（pHIS2-MADS6+pGADT7-DoAP3-3）在SD-TL、SD-TLH平板上能正常生长，在SD-TLH+40 mmol/L 3AT平板微弱生长，表明DoAP3-3与酵母中MADS6的启动子存在相互作用。

3　讨论

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花是被子植物独有的非常重要的观赏及生殖器官。花器官在大小、形态、颜色等方面均有差异，但决定花器官身份特性的潜在遗传和分子机制是高度保守的，花器官的基本身份特征由一套核心的基因和调控网络决定，这些基因通过调节不同下游基因集的表达来控制花器官的发育和特征，而这种调控机制涉及复杂的基因网络和环境影响，以确保花器官在保持基本身份特征的同时，表现出丰富的特异性，如兰科植物由花瓣特化而来的唇瓣。

MADS6在水稻中是AGL6-like的同源基因，调节花器官身份和花分生组织决定性。在AGL6-like突变体的花中，内稃和浆片的身份受到干扰，并观察到浆片-雄蕊的镶嵌器官^[23]；TSAI等^[24]在蝴蝶兰中分离得到了1个GLOBOSA/PISTILLATA样基因PeMADS6，PeMADS6的表达集中在萼片、花瓣和唇瓣原基中，通过异位过表达PeMADS6的拟南芥植物的花显示出花瓣状萼片的形态。有研究表明，靶基因NAC054的同源基因CUC1突变会导致花器官的轻微融合，而双重突变体（CUC1和CUC2同时突变）则表现出严重的花器官融合现象^[25]。AG作为MIKCc型MADS-box家族中的C类基因，不仅控制雄蕊、心皮的分化和发育，还调控花分生组织的终止^[26-27]。在AG基因突变体植株中，WUS基因的高调表达能够诱导花分生组织发育过程产生不确定性，使得AG基因突变体植株的花器官出现只含萼片和花瓣，且数量不确定的轮轴，产生“花嵌花”的表型^[28]。本研究结果发现，在DoAP3-3过表达植株花朵表型中出现了花瓣-萼片的镶嵌器官，MADS6、AG基因在过表达植株花朵中的表达量显著高于野生型，NAC054在野生型和过表达植株中的表达量均较低，在过表达植株中表达量几乎为0。因此，过表达植株花朵出现花瓣-萼片镶嵌器官可能是转录因子DoAP3-3正调控MADS6、AG基因，镶嵌器官可能是花瓣状萼片，也可能是DoAP3-3负调控NAC054造成花瓣和萼片基部融合现象。

PRS是WOX3的一个同源基因，在PRS突变体中，PRS基因的表达受到抑制，导致侧生萼片发育受到抑制，萼片边缘细胞缺失，侧生萼片缺失或变小，导致发育不对称，从而造成花器官形态异常等现象^[29]。本研究获得的DoAP3-3过表达植株花朵中，花器官萼片左右两侧大小不一，右侧萼片明显大于左侧萼片，且WOX3基因在野生型植株花朵中不表达，在过表达植株花朵中低表达，这表明WOX3基因的过表达和低表达均会影响萼片发育。AS2^[30]作为AS2/LOB（基因家族的成员，除了在叶片极性形成中调节外，在花发育中具有独立的功能^[31]。AS2与ASL^[32]相互作用共同调控花瓣的近端-远端对称性，从而影响花瓣形态和功能。在单突变体（AS2或ASL1）中，花瓣的形态发育异常并不明显，但在双突变体（AS2和ASL1）中，花瓣的形态异常更加显著；ASL1和AS2的过表达会导致BP表达的下调，而BP的过表达则会导致花瓣形态异常，如花瓣变长和向外卷曲，因此ASL1和AS2通过抑制KNOX基因（如BP）的表达来调控花瓣的极性^[33]。在某些极性异常的花瓣中，由于细胞扩展和分化异常导致花瓣基部可能出现膨大现象；或花瓣可能偏离正常位置，导致花对称性破坏；或导致花瓣与萼片等其他花器官的重叠现象，影响花的整体形态。因此AS2可能通过与其他基因相互作用，影响花瓣和萼片的近端-远端极性，在维持花器官正常形态和对称性中发挥重要作用。

NAP作为NAC029的同源基因，在模式植物拟南芥中已被鉴定为是花同源基因APETALA3/PISTILLATA的直接靶标，参与调控花瓣和雄蕊的形成，该研究在拟南芥中敲除了AP3-3，导致花瓣被萼片状的器官替代，雄蕊被心皮状的器官替代，通常与第四轮的心皮融合^[34]。而NAP基因的过表达会造成花瓣和雄蕊生长受抑制，导致花瓣短小且雄蕊缩短，因此NAP正常表达是保证花瓣和雄蕊细胞适时扩张和器官成熟的关键。本研究鉴定出NAC029在过表达植株中的表达量高于野生型，NAC029与NAP基因属于同源基因，这表明其功能可能在一定程度上是保守的，可能存在保守的TF-Target关系，因此推测NAC029或许是转录因子DoAP3-3的关键靶基因之一。

ERECTA基因影响细胞分裂的速率和模式，被认为是植株在不同发育环境下的生长调节因子，ERECTA编码一个富含亮氨酸重复片段的类受体丝氨酸/苏氨酸激酶，它与细胞的增殖有关并且被认为是植物生长因子受体^[35]。在ER突变体中，花器官的细胞分裂速率降低会导致细胞数量减少；ER基因的过表达会促进细胞分裂和扩展。在过表达ER基因的植物中，细胞分裂速率加快，细胞体积增大，从而导致组织和器官的增大，这表明ER基因在维持正常的细胞分裂速率中发挥重要作用^[36]。大多数花器官是从变态叶发育而来的，ER可以通过控制花瓣细胞增殖来调节花瓣的形状和大小，有研究者推测ER可能是控制不同植物花器官形态差异的主要因素^[37]。兰科植物唇瓣是花瓣特化而来，在DoAP3-3过表达花器官中，ERECTA的表达量显著高于野生型，且ERECTA在启动子范围内有2个结合峰，与转录因子DoAP3-3结合强度较强，结合其功能特征，这或许可以解释过表达植株唇瓣比野生型唇瓣明显增大的原因。

本研究成功鉴定出转录因子DoAP3-3的7个靶标基因，DoAP3-3通过结合GA/CT基序来调控这7个靶基因的表达。CArG box motif [CC（A+T-rich）6GG]是AP3-3最常见的结合位点^[17]，MADS结构域蛋白已被证明在体外可以与非CArG盒序列结合^[38]，这意味其在基因表达调控中有更广泛的多样性和复杂性。即使这些基因调控序列中不存在CArG盒，DoAP3-3结构域蛋白仍然有可能与其他基序结合，并调控这些基因的表达。本研究通过酵母单杂交实验验证DoAP3-3与MADS6之间存在相互作用，表明DoAP3-3通过调控MADS6的表达，进而影响花型发育。DoAP3-3是否与其他靶基因之间存在相互作用，后续还需进行转录因子与靶基因启动子互作实验研究。

4　结论

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DAP-seq作为体外检测转录因子结合位点的一种方法，成功将体内结合实验转移到体外，极大地提高了DNA结合位点发现的效率，可用于非模式植物转录因子的研究。在本课题组的前期研究基础上，通过瓶内开花技术，培育出铁皮石斛过表达植株花朵，并对其进行转录组测序分析；通过DAP-seq和RNA-seq联合分析成功鉴定出与转录因子DoAP3-3直接结合并调控花型形态发育的7个关键候选靶标基因：MADS6、NAC029、NAC054、WOX3、AS2、ERECTA、AG。这些基因可能通过特异性调控或与其他基因相互作用，在调控花型形态发育中发挥重要功能。该研究为初步解析花器官特征基因DoAP3-3与其靶基因之间的调控机制，探究兰科植物中高度特化和多样化的花形态形成机理奠定基础。

基金

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国家自然科学基金项目(32260419)
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2025年第46卷第5期

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文章信息

doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.05.004

接收时间：2024-12-26
首发时间：2026-06-26
出版时间：2025-05-25

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作者

出版历史

收稿日期：2024-12-26
录用日期：2025-02-06

基金

国家自然科学基金项目(32260419)

云南省教育厅项目(A3032024393)

作者信息

云南农业大学园林园艺学院，云南昆明　650201

通讯作者:

^* 和凤美（HE Fengmei），E-mail：hefengmei918@126.com。

参考文献

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/rdzwxb/CN/10.3969/j.issn.1000-2561.2025.05.004

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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