热带作物学报

基因名称Gene name	基因IDGene ID	氨基酸数目Number of amino acid/aa	分子量Molecular weight/Da	等电点Theoretical pI	不稳定指数Instability index	脂肪族指数Aliphatic index	平均亲水性Grand average of hydropathicity	定位Location
CaNMT1c	Chr1c006347	252	28 575.75	8.11	53.86	75.44	–0.297	细胞质
CaNMT2c	Chr1c006370	384	43 276.26	5.38	54.07	87.60	–0.246	细胞质
CaNMT3c	Chr1c006565	107	11 957.56	5.51	37.61	88.60	–0.277	细胞质
CaNMT4c	Chr1c006566	192	21 514.33	5.62	54.53	89.38	–0.152	叶绿体
CaNMT5c	Chr1c006585	130	14 554.80	8.60	30.79	87.85	–0.188	细胞质
CaNMT6c	Chr2c011551	297	33 539.09	5.44	46.44	89.33	–0.115	细胞质
CaNMT7c	Chr5c026745	207	23 498.15	8.22	51.26	95.17	0.004	细胞质
CaNMT8c	Chr9c039876	385	43 270.65	5.69	44.13	90.42	–0.168	细胞质
CaNMT9c	Chr9c039878	392	44 341.90	5.27	39.32	96.96	–0.101	细胞质
CaNMT10c	Chr9c039881	378	42 747.12	5.40	42.85	93.65	–0.170	细胞质
CaNMT11c	Chr9c039884	343	38 601.50	5.53	42.34	98.05	–0.133	细胞质
CaNMT12c	Chr9c039886	394	44 735.03	5.41	48.20	86.40	–0.201	细胞质
CaNMT13c	Chr11c004549	360	39 684.31	5.76	43.37	86.42	–0.114	细胞质
CaNMT14c	Chr11c004550	145	15 946.17	5.89	47.23	96.90	0.027	细胞质
CaNMT15e	Chr1e048197	384	43 163.23	5.48	52.17	89.64	–0.249	细胞质
CaNMT16e	Chr1e048199	416	46 992.74	5.34	53.06	91.39	–0.161	细胞质
CaNMT17e	Chr1e048201	389	44 039.35	5.40	50.37	90.98	–0.211	细胞质
CaNMT18e	Chr1e048416	152	17 205.88	9.03	32.39	91.78	–0.189	细胞质
CaNMT19e	Chr1e048556	227	25 413.36	5.95	41.39	95.33	–0.002	叶绿体
CaNMT20e	Chr2e053130	207	23 134.31	5.23	42.97	94.64	–0.196	细胞质
CaNMT21e	Chr4e065015	367	41 987.88	6.25	49.22	78.58	–0.344	细胞质
CaNMT22e	Chr5e067541	197	22 161.58	8.24	53.75	95.08	0.030	细胞质
CaNMT23e	Chr9e081520	385	43 270.56	5.41	43.42	93.71	–0.161	细胞质
CaNMT24e	Chr9e081521	318	36 062.20	5.02	43.27	94.37	–0.190	细胞质
CaNMT25e	Chr9e081529	384	43 405.72	5.58	40.77	92.45	–0.180	细胞质
CaNMT26e	Chr9e081533	385	43 530.06	5.70	39.64	97.48	–0.119	细胞质
CaNMT27e	Chr9e081536	241	27 255.03	5.31	39.39	92.28	–0.305	细胞质

基因名称Gene name	基因IDGene ID	氨基酸数目Number of amino acid/aa	分子量Molecular weight/Da	等电点Theoretical pI	不稳定指数Instability index	脂肪族指数Aliphatic index	平均亲水性Grand average of hydropathicity	定位Location
CaNMT1c	Chr1c006347	252	28 575.75	8.11	53.86	75.44	–0.297	细胞质
CaNMT2c	Chr1c006370	384	43 276.26	5.38	54.07	87.60	–0.246	细胞质
CaNMT3c	Chr1c006565	107	11 957.56	5.51	37.61	88.60	–0.277	细胞质
CaNMT4c	Chr1c006566	192	21 514.33	5.62	54.53	89.38	–0.152	叶绿体
CaNMT5c	Chr1c006585	130	14 554.80	8.60	30.79	87.85	–0.188	细胞质
CaNMT6c	Chr2c011551	297	33 539.09	5.44	46.44	89.33	–0.115	细胞质
CaNMT7c	Chr5c026745	207	23 498.15	8.22	51.26	95.17	0.004	细胞质
CaNMT8c	Chr9c039876	385	43 270.65	5.69	44.13	90.42	–0.168	细胞质
CaNMT9c	Chr9c039878	392	44 341.90	5.27	39.32	96.96	–0.101	细胞质
CaNMT10c	Chr9c039881	378	42 747.12	5.40	42.85	93.65	–0.170	细胞质
CaNMT11c	Chr9c039884	343	38 601.50	5.53	42.34	98.05	–0.133	细胞质
CaNMT12c	Chr9c039886	394	44 735.03	5.41	48.20	86.40	–0.201	细胞质
CaNMT13c	Chr11c004549	360	39 684.31	5.76	43.37	86.42	–0.114	细胞质
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CaNMT26e	Chr9e081533	385	43 530.06	5.70	39.64	97.48	–0.119	细胞质
CaNMT27e	Chr9e081536	241	27 255.03	5.31	39.39	92.28	–0.305	细胞质

咖啡NMT基因家族鉴定及不同时期WGCNA表达网络分析

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张妍冰 ¹ , 王曦奥 ¹ , 黄丽芳 ¹ , 吉训志 ¹ , 方晓峰 ¹ , 闫林 ¹^,² , 胡丽松 ¹^,² , 廖振阳 ¹^,²^,^*

热带作物学报 | 组学与生物技术 2025,46(12): 2840-2854

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热带作物学报 |组学与生物技术 2025 , 46 (12) : 2840 -2854

咖啡NMT基因家族鉴定及不同时期WGCNA表达网络分析

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张妍冰¹, 王曦奥¹, 黄丽芳¹, 吉训志¹, 方晓峰¹, 闫林¹^,², 胡丽松¹^,², 廖振阳¹^,²^,^*

作者信息

^1.中国热带农业科学院香料饮料研究所/农业农村部香辛饮料作物遗传资源利用重点实验室/咖啡海南省工程研究中心/热带香料饮料国际联合研究中心，海南万宁　571533

^2.中国热带农业科学院三亚研究院/热带作物生物育种全国重点实验室，海南三亚　572024

通讯作者:

^* 廖振阳（LIAO Zhenyang），E-mail：zhenyangliao@catas.cn。

Genome-wide Identification of the NMT Gene Family and Stage-Specific WGCNA in Coffea

Yanbing ZHANG¹, Xi’ao WANG¹, Lifang HUANG¹, Xunzhi JI¹, Xiaofeng FANG¹, Lin YAN¹^,², Lisong HU¹^,², Zhenyang LIAO¹^,²^,^*

Affiliations

^1.Spice and Beverage Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Genetic Resources Utilization of Spice and Beverage Crops, Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hainan Research Center for Coffee / International Joint Research Center for Tropical Spice Beverages, Wanning, Hainan 571533, China

^2.Sanya Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / National Key Laboratory of Tropical Crop Biological Breeding, Sanya, Hainan 572024, China

出版时间: 2025-12-25 doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.12.003

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摘要

收起

咖啡作为全球范围内重要的经济作物之一，广泛种植于热带和亚热带地区，是众多国家和地区的经济收入来源。咖啡因（1,3,7-三甲基黄嘌呤）是咖啡豆的主要次生代谢产物，不仅赋予咖啡独特的苦涩风味和提神功效，还发挥多重生物学功能。其中，N-甲基转移酶（NMT）基因家族在咖啡因生物合成途径中发挥关键作用。因此，系统鉴定咖啡NMT基因家族成员并解析其在不同发育时期的表达模式，对于探究咖啡因代谢、优化咖啡品质及抗逆育种具有重要意义。本研究在异源四倍体小粒种咖啡中共鉴定到27个NMT家族基因，其中C亚基因组14个基因，E亚基因组13个基因，分布在10条染色体上。基因结构显示，成员之间基序组成较为相似，但内含子排列和数量有差异。顺式作用元件分析发现，小粒种咖啡CaNMT基因启动子区富含多种顺式作用元件，涉及光应答、胁迫响应和激素信号转导，并包含MYB、MYC和W-box等转录因子结合位点。进一步通过转录组分析发现小粒种咖啡果实发育过程中基因呈现动态表达，果实变色期差异表达基因数目最多（14 703个），而果实膨大期数量最少（4419个）。小粒种咖啡NMT家族基因在果实不同发育时期及不同组织中也表现出明显的动态与特异性。通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）构建12个共表达模块，ivory、coral1和darkolivegreen模块分别富集环境应激与蛋白折叠、能量代谢、核酸代谢相关通路。核心基因网络阐明了CaNMT基因在咖啡因代谢、应激响应及发育调控中的关键作用。本研究系统鉴定了异源四倍体小粒种咖啡NMT家族基因，并研究了该家族在不同果实发育时期的表达模式，阐明了不同基因的功能，为咖啡育种提供理论依据。

关键词

咖啡 / NMT基因家族 / WGCNA / 果实发育

Abstract

收起

Coffee, one of the most important economic crops worldwide, is widely cultivated in tropical and subtropical regions and serves as a major source of income for many countries and regions. Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is the main metabolite in coffee beans and related products, which not only imparts the characteristic bitter taste and stimulates effect of coffee but also exerts multiple biological functions. The N-methyltransferase (NMT) gene family plays a key role in the caffeine biosynthetic pathway. Therefore, systematic identification of coffee NMT family members and analysis of the expression patterns at different developmental stages are of great importance for investigating caffeine metabolism, improving coffee quality, and breeding stress-resistant varieties. In this study, a total of 27 NMT genes were identified in allotetraploid Coffea arabica, including 14 genes from the C subgenome and 13 from the E subgenome, distributed across 10 chromosomes. Gene structure analysis revealed that family members shared similar motif compositions but differed in intron arrangement and number. Cis-acting element analysis showed that the promoters of C. arabica NMT genes were enriched with various regulatory elements related to light response, stress response and hormone signaling, and contained transcription factor binding sites such as MYB, MYC and W-box. Transcriptome analysis further demonstrated that NMT genes exhibited dynamic expression during fruit development, with the ripening stage showing the highest number of differentially expressed genes (14 703), while the expansion stage showed the lowest (4419). Moreover, C. arabica NMT genes displayed clear temporal and tissue-specific expression patterns. Weighted gene co-expression network analysis (WGCNA) identified 12 co-expression modules, among which the ivory, coral1 and darkolivegreen modules were enriched in pathways related to environmental stress and protein folding, energy metabolism and nucleic acid metabolism, respectively. Core gene network analysis revealed the critical roles of NMT genes in caffeine metabolism, stress response, and developmental regulation. Taken together, this study systematically identified the NMT gene family in allotetraploid C. arabica, characterized the expression patterns during different stages of fruit development, and elucidated the potential functional differentiation, thereby providing a theoretical basis for coffee breeding.

Key words

Coffea / NMT gene family / WGCNA / fruit development

引用本文

张妍冰, 王曦奥, 黄丽芳, 吉训志, 方晓峰, 闫林, 胡丽松, 廖振阳. 咖啡NMT基因家族鉴定及不同时期WGCNA表达网络分析. 热带作物学报, 2025 , 46 (12) : 2840 -2854 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.12.003

Yanbing ZHANG, Xi’ao WANG, Lifang HUANG, Xunzhi JI, Xiaofeng FANG, Lin YAN, Lisong HU, Zhenyang LIAO. Genome-wide Identification of the NMT Gene Family and Stage-Specific WGCNA in Coffea[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2025 , 46 (12) : 2840 -2854 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.12.003

正文

收起

咖啡（Coffea）是一种在全球范围内广泛种植的热带经济作物，其种子烘焙制成的饮品深受消费者喜爱^[1]。咖啡产业链涵盖了种植、加工、贸易、烘焙和零售等多个环节^[2]，在全球贸易中占据重要地位，是许多热带国家的重要出口创汇产品之一^[3]。咖啡风味的形成涉及多种化学成分，包括挥发性化合物（如醛类、酮类和酯类）和非挥发性化合物（如绿原酸、咖啡因和多糖），这些成分在咖啡豆的种植、加工、烘焙和冲泡过程中发生复杂的化学变化，最终决定了咖啡的香气和口感^[4-5]。咖啡因（1,3,7-三甲基黄嘌呤）是咖啡豆及相关制品中的主要代谢产物，不仅赋予咖啡独特的苦涩风味和提神功效，还在抗氧化、心血管健康和代谢调节等方面具有重要作用^[6-7]。近年来，中粒种咖啡（Coffea canephora）参考基因组^[8]与多套高质量的小粒种咖啡（C. arabica）基因组^[9-10]相继发表，为咖啡风味解析和品质改良提供了研究基础。小粒种咖啡为异源四倍体（2n=4x=44），源自C. eugenioides与C. canephora的天然杂交^[9]，已有研究表明2个亚基因组在咖啡因、萜类及脂肪酸合成等关键代谢基因簇中呈现局部表达偏倚^[11-12]，这为等位及同源基因的互作网络解析提供了思路。

NMT基因家族属于甲基转移酶超家族，负责催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）依赖的甲基化反应，在咖啡因生物合成中发挥核心作用。NMT在咖啡属植物中的序列保守性较高^[13]，该家族主要包括黄嘌呤甲基转移酶（XMT）、7-甲基黄嘌呤甲基转移酶（MXMT）和3,7-二甲基黄嘌呤甲基转移酶（DXMT），分别催化咖啡因合成途径中的3个关键步骤：从黄苷到7-甲基黄苷、7-甲基黄嘌呤到可可碱，以及可可碱到咖啡因。已有研究克隆出小粒种咖啡中CaXMT1、CaMXMT和CaDXMT1/CCS1基因并进行功能鉴定，明确了其底物专一性和催化顺序^[14-15]。通过结构生物学分析，进一步解析中粒种咖啡中XMT和DXMT的SAM依赖甲基转移机制及其底物选择的关键决定因子^[16]。在基因组分布方面，已有研究发现小粒种咖啡中控制咖啡因生物合成的NMT基因主要位于1号和9号染色体，呈基因聚簇分布特性^[8]。DXMT基因在咖啡因合成最后一步中起关键作用，其在Chr1上的结构变异与咖啡因含量种间差异相关。此外，Chr9c和Chr9e上XMT和MXMT基因形成功能性基因簇，序列保守性高。这些特征为研究NMT基因家族的功能分化及咖啡因代谢调控提供了重要基础。在表达模式方面，NMT基因在幼叶、花芽和未成熟果实中表达丰度较高，与体内甲基黄嘌呤和咖啡因的积累趋势一致。C. canephora中DXMT基因在绿色果实中的表达水平最高，而在C. eugenioides中，DXMT基因仅在绿色果实阶段显著表达，且受同源特异性重复DNA调控^[17]。利用RNAi技术抑制CaMXMT基因可同步降低可可碱和咖啡因含量，验证了可可碱作为咖啡因合成通路关键中间体的功能节点^[18]。NMT基因家族不仅在咖啡因生物合成中至关重要，还在植物代谢调控和适应性进化中发挥广泛作用。例如，拟南芥中NMT基因功能缺失会导致植物生长和繁殖能力受损^[19]。

加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）是一种系统生物学方法，通过构建基因表达的共表达网络，挖掘基因间的协同表达关系及其与表型性状的关联^[20]。近年来，WGCNA广泛应用于植物基因功能研究，如水稻抗逆基因网络^[21]、玉米籽粒发育调控^[22]等。然而，在咖啡研究中，WGCNA的应用尚处于起步阶段，尤其针对NMT基因家族在咖啡不同发育时期的共表达网络分析仍显不足。利用WGCNA方法，可系统解析NMT基因与其他基因间的共表达关系，挖掘关键调控模块及候选基因，为揭示咖啡因代谢的分子机制提供新视角。

近年来，咖啡基因组学研究在高通量测序技术和生物信息学工具的推动下取得了重要突破，为解析咖啡因代谢的分子机制提供了坚实基础。本研究旨在通过全基因组分析鉴定咖啡NMT基因家族成员，结合RNA-seq数据，系统解析其在不同发育时期的表达模式，并利用WGCNA方法构建NMT基因的共表达网络，挖掘关键调控模块及候选基因。研究结果将为咖啡因代谢的深入研究提供数据支持，并为咖啡品质改良及抗逆育种提供新的理论基础。

1　材料与方法

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1.1　材料

选取生长于海南省兴隆热带植物园咖啡种质资源圃中长势良好的小粒种咖啡多年生植株为试验材料，分别采集其根、茎、叶以及5个不同发育时期的果实样品（Fruit-1为坐果期；Fruit-2为幼果期；Fruit-3为果实膨大期；Fruit-4为果实变色期；Fruit-5为果实成熟期），取样结束后，立即将咖啡种子与果肉分离，所有组织迅速置于液氮中速冻，并保存于–80 ℃，后续用于测序分析。

1.2　方法

1.2.1　小粒种咖啡NMT基因家族的鉴定

从NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下载中粒种咖啡NMT基因的CDS序列、蛋白序列，基于小粒种咖啡基因组数据，利用BLASTN^[23]比对工具，获取与已知NMT基因相似的序列，获得小粒种的NMT候选基因，E-value设置为1e-5。使用SMART^[24]工具进行保守结构域验证，删除不具备完整结构和氨基酸长度小于100 aa的序列，经去重复后最终获得CaNMT基因。

1.2.2　 CaNMT基因理化性质和亚细胞定位分析

采用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam）推测CaNMT蛋白的长度、等电点和理论分子量。使用Softberry Home Page（http://linux1.softberry.com/berry.phtml）网站对CaNMT基因进行亚细胞定位预测。

1.2.3　咖啡NMT基因家族系统进化树和染色体定位分析

利用MEGA^[25]软件中的MUSCLE模块，对小粒种咖啡NMT基因家族成员的全长氨基酸序列进行多序列比对。随后，使用MEGA软件Find Best DNA/Protein Models功能评估并确定最优的进化模型，其中缺失数据处理方式选择partial deletion。通过邻接法（neighbor-joining, NJ）构建系统进化树，并对树的分支可靠性进行自展检验（bootstrap），重复次数设定为1000次。此外，从小粒种咖啡基因组注释文件中获取NMT基因家族成员的染色体定位信息，利用TBtools^[26]软件绘制染色体定位分布图。

1.2.4　基因家族的基因结构和保守结构域分析

采用GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析CaNMT基因结构；采用MEME（http://meme-suite.org/）分析其蛋白序列的保守结构域，最大结构域数目设置为10。利用bedtools^[27]工具提取CaNMT基因上游1500 bp序列，提交至PlantCare（https://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）进行顺式作用元件预测，对预测结果进行汇总、筛选和简化后通过TBtools软件对预测的顺式作用元件进行可视化分析。

1.2.5　转录组分析及WGCNA分析

转录组原始数据经fastp软件过滤后，使用HISAT^[28]工具进行比对，并利用featureCount^[29]软件获取reads数，经过矫正后获取基因表达TPM值。基于TPM表达矩阵使用R软件WGCNA包进行共表达网络分析，其中以中位数绝对偏差（MAD）过滤低变异基因，用goodSamplesGenes剔除异常基因后进行样本层次聚类质控，用pickSoftThreshold确定软阈值β，构建邻接矩阵并转为拓扑重叠矩阵（TOM），然后在TOM距离上层次聚类，采用动态剪切识别模块（minModuleSize=50，deepSplit=2），并在特征基因（ME）间距离<0.33合并相近模块。对每个模块计算ME，并与表型矩阵做Pearson相关分析，同时计算每个基因的模块归属度（MM/kME）和对性状的基因显著性（GS）。结果通过样本树+性状热图、模块–性状相关热图及TOM子网络热图等进行可视化，并将各模块的TOM子网（阈值为0.02）导出为Cytoscape边/节点文件。提取CaNMT基因所在模块的基因集后，使用TBtools软件进行KEGG富集分析。

2　结果与分析

收起

2.1　 CaNMT基因鉴定及理化性质分析

基于小粒种基因组，共筛选出27个CaNMT基因。理化性质分析结果显示，小粒种咖啡NMT基因家族成员的蛋白质特性具有多样性（表1）。CaNMT蛋白的氨基酸长度范围在107~416 aa之间，其中，CaNMT3c编码的蛋白长度最短，仅为107 aa，而CaNMT16e编码的蛋白长度最长，达到416 aa。这种长度的差异可能与基因的功能分化及其在咖啡因代谢途径中的具体作用相关。预测的分子质量范围为11957.56 Da（CaNMT3c）~46992.74 Da（CaNMT16e），反映了CaNMT蛋白在结构复杂性上的差异。理论等电点（pI）分布在5.02（CaNMT24e）~9.03（CaNMT18e）之间，表明NMT蛋白的电荷性质差异较大。其中，CaNMT1c（pI 8.11）、CaNMT7c（pI 8.22）、CaNMT22e（pI 8.24）、CaNMT5c（pI 8.60）以及CaNMT18e（pI 9.03）为碱性蛋白（pI>7），而其余蛋白均为酸性蛋白（pI<7）。这种酸碱性差异可能影响蛋白质在细胞环境中的稳定性和相互作用特性。

不稳定指数的分析显示，NMT蛋白的不稳定指数范围为30.79（CaNMT5c）~54.53（CaNMT4c），其中大部分蛋白的不稳定指数高于40，表明多数NMT蛋白在体外环境中可能具有较低的稳定性，需依赖特定的细胞环境或伴侣蛋白以维持其功能活性。脂肪族指数介于75.44（CaNMT1c）~98.05（CaNMT11c）之间，较高的脂肪族指数提示NMT蛋白具有较多的疏水性氨基酸，这可能与其在细胞内的折叠和膜相关功能有关。平均亲水性值在–0.344（CaNMT21e）~0.030（CaNMT22e）之间，均偏向负值，表明NMT蛋白总体呈现亲水性，有利于其在水性细胞环境中发挥功能，仅少数蛋白如CaNMT22e（0.03）和CaNMT14c（0.027）接近中性。

亚细胞定位预测结果显示，NMT基因家族成员的蛋白产物主要分布于细胞质，少数分布于叶绿体，反映了其在代谢过程或蛋白质修饰中的潜在功能。具体而言，在分析的27个成员中，2个蛋白（CaNMT4c、CaNMT19e）定位于叶绿体，其余定位于细胞质。这种分布模式表明NMT基因家族的蛋白产物主要在细胞质中执行功能，可能与N-甲基转移酶相关的代谢途径或蛋白质修饰过程密切相关。叶绿体定位的蛋白（CaNMT4c和CaNMT19e）可能参与光合作用相关的次生代谢产物的合成或调控，提示NMT基因家族在不同亚细胞环境中具有多样化的生物学功能。

2.2　 NMT基因染色体定位及系统进化分析

27个CaNMT基因分布在咖啡的10条染色体上（图1），整体呈现不均衡的分布格局。其中，NMT基因在C与E亚基因组的Chr1与Chr9上均显示出明显的富集趋势，Chr1c、Chr1e、Chr9c和Chr9e各含5个基因；而在Chr2（Chr2c和Chr2e）和Chr5（Chr5c和Chr5e）上则仅各有1个基因。这种分布模式可能与基因复制事件或染色体重排相关。此外，Chr11c上分布有2个基因，而Chr4e仅检测到1个基因。此外，虽然Chr1、Chr2、Chr5和Chr9在C与E亚基因组间均表现出一致的基因分布模式，但C亚基因组的Chr11c包含2个NMT基因（CaNMT13c和CaNMT14c），而E亚基因组的Chr4e仅含1个基因（CaNMT21e），显示出亚基因组间在基因分布模式上的不对称性。

为了明确NMT基因家族的系统进化关系，对茶（Camellia）、可可（Theobroma）和咖啡（Coffea）61个NMT蛋白全长序列进行了系统进化树构建，其中（图2）。分析结果显示，咖啡NMT基因在进化树中形成1个独立的聚类分支，表明其在进化过程中具有较高的特异性。茶和可可的NMT基因在进化树中聚类较近，显示出较高的序列相似性。此外，进化树中还观察到相比于中粒种咖啡，小粒种咖啡中NMT基因出现收缩现象，多个CcNMT基因比对为同一个CaNMT基因，如图2所示，CcNMT14、CcNMT18、CcNMT19基因均与CaNMT3c同源，反映了基因家族在进化过程中的收敛或功能冗余。

2.3　 CaNMT基因结构与保守结构域分析

为进一步了解CaNMT基因系统进化与其编码蛋白中保守基序及其基因结构之间的关系，对NMT编码蛋白保守基序以及外显子与内含子的结构进行了分析。基因结构分析表明，CaNMT基因的外显子（Exon）-内含子（Intron）组成呈现多样性，外显子数量在1~6个之间变化，例如CaNMT14c和CaNMT18e基因外显子较少，而CaNMT1c基因外显子数量较多（图3），显示出基因结构上的异质性。保守基序分析结果进一步表明，NMT家族成员均包含1个核心保守基序，属于Methyltransf_7家族或其超家族（Methyltransf_7 superfamily）（图3），反映了NMT蛋白在功能上的保守性及潜在的多样化作用。

2.4　顺式作用元件分析

CaNMT基因含有大量的顺式作用元件，主要参与光应答、胁迫响应和激素响应。在光响应调控方面，CaNMT基因启动子包含16种不同的光响应元件，这些元件广泛分布于27个CaNMT基因的启动子区域，包括AE-box、TCT-motif、ACE、GT1-motif、I-box、ATCT-motif、Box 4、C-box、G-box、GA-motif、GATA-motif、AT1-motif、MRE、Sp1和chs-CMA2a等（图4）。这些元件可能介导CaNMT基因对光周期、光质及光照强度变化的响应。例如，CaNMT4c和CaNMT15e等基因启动子中富含G-box和I-box元件，可能增强对光周期和光质变化的敏感性，而CaNMT1c和CaNMT20e中ATCT-motif的出现表明其对光照强度变化的特定响应。这些光响应元件可能通过调控CaNMT基因的转录水平，协调咖啡因生物合成与光照条件之间的动态平衡。

在胁迫响应方面，共鉴定出5类典型的胁迫相关顺式作用元件：TC-rich repeats、MBS、LTR、GC-motif和ARE。例如，CaNMT18e和CaNMT22e中富集TC-rich repeats和MBS元件，分别参与防御应激反应和干旱胁迫适应；CaNMT1c和CaNMT20e中LTR和GC-motif的分布表明其对低温和厌氧条件的潜在响应能力。这些元件的存在表明NMT基因可能通过调控咖啡因含量在植物抗逆应答中发挥独特作用，尤其是面对干旱和低温等环境胁迫时，咖啡因作为次生代谢产物的抗逆特性可能与CaNMT基因的表达调控密切相关。

在植物激素信号转导方面，CaNMT基因启动子包含多种激素响应元件，比如生长素（IAA）响应元件（TGA-element、AuxRR-core）、水杨酸（SA）响应元件（TCA-element）、赤霉素（GA）响应元件（P-box、TATC-box）、茉莉酸甲酯（MeJA）响应元件（CGTCA-motif、TGACG-motif）和脱落酸（ABA）响应元件（ABRE）。例如，CaNMT26e和CaNMT18e中TGA-element和AuxRR-core的富集可能增强对IAA信号的敏感性，而CaNMT10c和CaNMT21e中CGTCA-motif的分布提示其对MeJA介导的防御反应的调控潜力。

此外，启动子区域还包含类黄酮生物合成相关元件（MBSI，如CaNMT9c）、玉米醇溶蛋白代谢相关元件（O2-site，如CaNMT3c）、昼夜节律调控元件（circadian，如CaNMT19e）、细胞分化相关元件（HD-Zip 1，如CaNMT1c）、胚乳特异性表达元件（GCN4_motif，如CaNMT6c）以及分生组织表达相关元件（CAT-box，如CaNMT2c），这些元件参与特定生物学过程，可能与CaNMT基因在咖啡果实发育和种子成熟中的功能分化相关。

同时，CaNMT基因启动子区域还包含多种转录因子结合位点，包括MYB、MYC和W-box等。这些元件是相应转录因子识别并结合的特异性DNA序列，在调控基因表达中发挥关键作用。其中，W-box作为WRKY转录因子的典型结合基序，广泛参与植物胁迫响应和免疫防御；而MYB和MYC结合位点则与干旱、高盐、低温胁迫及多种植物激素信号通路的调控密切相关。

2.5　 CaNMT基因在不同组织中表达分析

对小粒种果实不同发育时期的转录组数据进行分析发现，果实发育Fruit-1、Fruit-2阶段有4797个差异表达基因，Fruit-2、Fruit-3阶段有4419个，Fruit-3、Fruit-4阶段高达14703个，而Fruit-4、Fruit-5阶段则为6339个。其中，Fruit-2、Fruit-3差异表达基因数量最少，Fruit-3、Fruit-4则最多（图5）。进一步比较发现，Fruit-1、Fruit-2时期特有1065个差异表达基因，Fruit-2、Fruit-3时期特有755个差异表达基因，Fruit-3、Fruit-4时期特有7662个差异表达基因，而Fruit-4、Fruit-5时期特有2062个差异表达基因。与各阶段间特有的基因相比，共享的差异表达基因数量相对较少，这表明特异性表达基因在果实发育中具有更重要的作用。对不同发育时期特有的差异表达基因进行KEGG富集，发现Fruit-1、Fruit-2阶段的基因主要参与跨膜转运、脂肪酸分解、昼夜节律以及过氧化物酶体等过程。Fruit-2、Fruit-3阶段，基因主要参与DNA修复与重组、蛋白质加工等过程，同时涉及部分氨基酸和脂类代谢。在Fruit-3、Fruit-4阶段，基因主要富集在光合作用、核苷酸代谢、能量代谢，以及泛素系统和RNA降解等关键通路。Fruit-4、Fruit-5阶段的基因主要参与糖酵解、氨基酸与脂类代谢、核糖体生成以及细胞骨架构建等核心活动（图5）。

对咖啡不同组织（根、茎、叶、果实）及果实不同发育时期（Fruit-1~Fruit-5）的转录组数据分析，CaNMT基因表现出动态的表达模式，并具有组织特异性（图6）。CaNMT2c在果实早期发育阶段（Fruit-1）表现出极高的表达量，在Fruit-2和Fruit-3阶段仍保持较高水平，但在Fruit-4和Fruit-5阶段逐渐下降，表明其可能在果实早期发育中具有重要作用。类似地，CaNMT11c在果实发育早期至中期（Fruit-1~Fruit-4）均维持较高表达量，仅在Fruit-5略有下降，显示其在果实成熟过程中具有持续的功能活性。相比之下，CaNMT16e在Fruit-1阶段表达较高，但在后续阶段迅速下降（Fruit-3后接近0），表明其功能主要集中在果实发育的初期。而CaNMT23e则在Fruit-4阶段达到表达峰值，远高于Fruit-1，表明其可能在果实后期发育中发挥重要作用。

CaNMT基因在果实（Fruit-5）、叶、根和茎等不同组织中展现出组织特异性。CaNMT2c在茎表达量最高，其次是叶和根，而果实中较低；CaNMT18e在茎表达高于叶和果实，表明其在茎部和叶片代谢中可能具有主要作用。CaNMT10c和CaNMT26e在叶表达量最高，Fruit-5较低，反映其在叶片光合作用或代谢中的重要性。CaNMT1c在根表达量最高，叶次之，Fruit-5极低，表明其可能与根部营养吸收相关。

2.6　咖啡不同时期WGCNA表达网络分析

通过转录组分析共获得6 6023个基因的表达谱数据，过滤低表达量的基因，获得高表达基因用于基因共表达网络构建。通过对权重值采用动态剪切树法合并表达相似的模块，获得12个共表达模块，不同的颜色代表不同的模块。每个模块包含的基因数目不同，darkseagreen 4模块包含基因数量最多，为9193个基因，grey模块包含基因数目最少，为279个基因，平均每个模块包含3159个基因（图7）。

按照|r|>0.70且P<0.005的标准，6个模块均与组织存在高度相关性，比如honeydew 1（r=0.98，P<1e-16）与根高度相关，black（r=0.92，P<1e-10）与茎高度相关，darkseagreen 4（r=0.91，P<7e-10）与叶高度相关（图8），ivory（r=0.93，P<7e-11）与果实高度相关。为筛选与咖啡发育相关基因，本研究对与咖啡发育显著关联的模块基因进行富集分析。

GO富集分析结果显示，在生物学过程（biological process）方面，ivory模块主要富集于与环境应激响应和蛋白质稳态维持相关的过程，包括响应高温（GO:0009408）、响应高光强度（GO:0009644）、蛋白质折叠（GO:0006457）等；coral1模块主要富集于与能量代谢相关的过程，包括碳水化合物磷酸化（GO:0046835）、丙酮酸生物合成过程（GO:0042866）、糖酵解过程（GO:0006096）等；darkolivegreen模块主要富集于核酸代谢过程，包括核酸代谢过程（GO:0090304）、RNA代谢过程（GO:0016070）、基因表达（GO:0010467）、mRNA代谢过程（GO:0016071）和RNA加工（GO:0006396）。在分子功能（molecular function）方面，ivory模块主要富集于半乳糖基转移酶活性（GO:0008378）；coral1模块主要富集于碳水化合物激酶活性（GO:0019200）；darkolivegreen模块主要富集于核酸内切酶活性（GO:0004519）。在细胞组分（cellular component）方面，ivory模块主要富集于脂滴（GO:0005811）和内质网（GO:0005783）；darkolivegreen模块主要富集于细胞内解剖结构（GO:0005622）和核蛋白复合物（GO:0140513）。coral1模块主要富集于细胞质（GO:0005829）（图9）。

KEGG富集分析结果显示，ivory模块主要富集在脂质代谢、半乳糖代谢和糖酵解/糖异生等通路；coral1模块主要富集在果糖和甘露糖代谢、蛋白质磷酸酶及其相关蛋白、半胱氨酸和蛋氨酸代谢等通路；darkolivegreen模块主要富集在维生素B₆代谢、谷胱甘肽代谢、植物昼夜节律等通路（图9）。

选取ivory、coral1和darkolivegreen模块中选取连通度排名前10的基因作为核心基因，并以权重值>0.20为标准，构建核心基因及其关联基因的互作网络图。在ivory模块中，筛选到NMT基因家族成员CaNMT15e和CaNMT20e；在darkolivegreen模块中，筛选到NMT基因家族成员CaNMT24e（图10）。

3　讨论

收起

本研究系统鉴定了小粒种咖啡NMT基因家族成员，解析了其在不同组织及果实不同发育时期的特异表达模式，并借助加权基因共表达网络分析（WGCNA）在多组织和果实发育阶段构建了共表达网络，进而在模块水平上分析了与NMT家族协同调控的核心基因，为后续研究提供了候选基因和潜在调控靶点。

基于基因组学分析，本研究鉴定到27个小粒种咖啡NMT家族基因，观察到其在Chr1和Chr9染色体上的基因聚簇分布，以及亚基因组间相似的分布格局，这符合局部复制与染色体重排共同塑造基因家族结构的机制^[30]。从结构域层面分析，家族成员普遍携带Methyltransf_7保守结构域，该域定义了底物识别与SAM依赖的转甲基化共同化学框架，为在相同催化框架上演化出位点特异性的N7/N3/N1甲基化提供了基础。已有研究基于GFP融合蛋白的原位观察，发现咖啡3类NMT（XMT/MXMT/DXMT）主要定位于细胞质，并可形成二聚体^{[16, 31]}，这与本研究的亚细胞定位预测结果基本一致，表明细胞质是咖啡因生物合成的主要场所。值得注意的是，本研究预测到CaNMT4c和CaNMT19e蛋白定位于叶绿体，这暗示NMT基因家族可能演化出了新的功能。叶绿体是多种次生代谢物（如部分萜类、生物碱）合成的场所^[32]，这2个NMT蛋白可能参与了与光合作用偶联的特定甲基化修饰过程，或催化了某种未知底物的合成，这为理解咖啡因之外的NMT功能提供了新线索。此外，理化性质分析揭示了CaNMT蛋白在氨基酸长度、等电点和稳定性上的显著多样性，这种多样性可能反映了不同成员在底物亲和力、酶活调控以及与其他蛋白相互作用模式上的分化，是基因家族成员功能细化的体现。此外，本研究在CaNMT基因启动子上检测到G-box、ACE、I-box等典型光响应元件，以及ABRE、TCA-element、MeJA和MBS等激素/胁迫响应元件。已有研究表明，G-box作为bZIP/bHLH（如HY5、MYC家族）转录因子的核心结合位点，调控大量次生代谢基因的表达^[33]；同时，JA/SA信号途径可直接调控咖啡或茶中咖啡因相关NMT基因的转录水平^[34-35]。这些发现表明环境因子和激素信号在调控咖啡NMT基因表达中具有重要作用。

在表达模式方面，本研究观察到CaNMT基因在果实转色期表现出显著的差异表达峰值，这与先前研究中咖啡果皮/种子发育过程中色素与挥发性化合物积累的转变以及碳代谢重分配的观点一致^[36-37]。相关研究显示，JA/SA处理可上调咖啡因合成途径中NMT基因的转录水平并提升咖啡因含量^[38]，且已鉴定的转录因子可直接激活关键合成酶基因的启动子^[39]，表明在果实发育关键节点，转录调控网络驱动了代谢通量的重新分配；然而，关于咖啡因是否作为内源信号分子及其通量调控的动态机制，仍需通过酶活性测定与同位素示踪等进一步验证。除了在果实中的动态表达，本研究还探究了CaNMT基因在根、茎、叶等器官中的组织特异性表达模式，这表明咖啡因在植物整体防御体系中的多重角色。这种组织特异性的表达模式，体现了植物在不同部位精准调配防御资源以应对环境胁迫的精细策略，也说明NMT基因家族的调控网络远比我们之前认为的更为复杂。

进一步结合WGCNA分析结果，本研究发现CaNMT15e和CaNMT20e这2个基因在与果实发育呈高度正相关的ivory模块中表现出高连通度。根据富集分析，ivory模块中的基因主要参与糖酵解/糖异生、半乳糖代谢和脂质代谢等核心能量代谢通路。咖啡因作为嘌呤生物碱，其生物合成是一个能量密集型过程，需要消耗大量的ATP^[40]。糖酵解等中心碳代谢途径正是细胞内ATP的主要来源，为合成反应提供必需的能量。因此，ivory模块中能量代谢通路的活跃，支持了细胞在果实成熟过程中维持高水平的ATP供应，这对于合成咖啡因至关重要。此外，所有NMT酶催化的甲基化反应均依赖S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体，而SAM的再生循环本身也高度依赖ATP供应。ivory模块中能量代谢通路的活跃，不仅为ATP供应提供保障，还通过维持细胞内SAM的高水平，确保CaNMT酶能够高效催化甲基化反应。另一方面，CaNMT24e在与RNA代谢和基因表达相关的darkolivegreen模块中处于核心地位，这表明咖啡因的合成调控不仅仅局限于代谢层面，还涉及转录及转录后等多个层次的精密调控，体现了其调控网络的复杂性。

已有研究通过RNAi技术抑制咖啡中MXMT和XMT等基因，成功获得了咖啡因含量显著降低的植株^{[18, 41]}。此外，在异源表达系统中同时表达XMT、MXMT和DXMT 3种酶，能够表现出抗虫效果^[42-43]。结合本研究的WGCNA模块分析和顺式元件解析，未来可利用CRISPR技术精准调控NMT基因家族核心成员或其启动子中的关键元件，从而实现降低咖啡因含量的同时保留咖啡风味和抗逆性的育种目标。

基金

收起

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(1630142024017)
国家热带植物种质资源库(NTPGRC2025-014)
国家木薯产业技术体系专项(CARS-11-HNYL)

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文献

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2025年第46卷第12期

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文章信息

doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.12.003

接收时间：2025-09-16
首发时间：2026-06-24
出版时间：2025-12-25

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作者

出版历史

收稿日期：2025-09-16
录用日期：2025-10-06

基金

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(1630142024017)

国家热带植物种质资源库(NTPGRC2025-014)

国家木薯产业技术体系专项(CARS-11-HNYL)

作者信息

^2.中国热带农业科学院三亚研究院/热带作物生物育种全国重点实验室，海南三亚　572024

通讯作者:

^* 廖振阳（LIAO Zhenyang），E-mail：zhenyangliao@catas.cn。

参考文献

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/rdzwxb/CN/10.3969/j.issn.1000-2561.2025.12.003

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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RefWorks
TxT

基因名称Gene name	基因IDGene ID	氨基酸数目Number of amino acid/aa	分子量Molecular weight/Da	等电点Theoretical pI	不稳定指数Instability index	脂肪族指数Aliphatic index	平均亲水性Grand average of hydropathicity	定位Location
CaNMT1c	Chr1c006347	252	28 575.75	8.11	53.86	75.44	–0.297	细胞质
CaNMT2c	Chr1c006370	384	43 276.26	5.38	54.07	87.60	–0.246	细胞质
CaNMT3c	Chr1c006565	107	11 957.56	5.51	37.61	88.60	–0.277	细胞质
CaNMT4c	Chr1c006566	192	21 514.33	5.62	54.53	89.38	–0.152	叶绿体
CaNMT5c	Chr1c006585	130	14 554.80	8.60	30.79	87.85	–0.188	细胞质
CaNMT6c	Chr2c011551	297	33 539.09	5.44	46.44	89.33	–0.115	细胞质
CaNMT7c	Chr5c026745	207	23 498.15	8.22	51.26	95.17	0.004	细胞质
CaNMT8c	Chr9c039876	385	43 270.65	5.69	44.13	90.42	–0.168	细胞质
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CaNMT12c	Chr9c039886	394	44 735.03	5.41	48.20	86.40	–0.201	细胞质
CaNMT13c	Chr11c004549	360	39 684.31	5.76	43.37	86.42	–0.114	细胞质
CaNMT14c	Chr11c004550	145	15 946.17	5.89	47.23	96.90	0.027	细胞质
CaNMT15e	Chr1e048197	384	43 163.23	5.48	52.17	89.64	–0.249	细胞质
CaNMT16e	Chr1e048199	416	46 992.74	5.34	53.06	91.39	–0.161	细胞质
CaNMT17e	Chr1e048201	389	44 039.35	5.40	50.37	90.98	–0.211	细胞质
CaNMT18e	Chr1e048416	152	17 205.88	9.03	32.39	91.78	–0.189	细胞质
CaNMT19e	Chr1e048556	227	25 413.36	5.95	41.39	95.33	–0.002	叶绿体
CaNMT20e	Chr2e053130	207	23 134.31	5.23	42.97	94.64	–0.196	细胞质
CaNMT21e	Chr4e065015	367	41 987.88	6.25	49.22	78.58	–0.344	细胞质
CaNMT22e	Chr5e067541	197	22 161.58	8.24	53.75	95.08	0.030	细胞质
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CaNMT25e	Chr9e081529	384	43 405.72	5.58	40.77	92.45	–0.180	细胞质
CaNMT26e	Chr9e081533	385	43 530.06	5.70	39.64	97.48	–0.119	细胞质
CaNMT27e	Chr9e081536	241	27 255.03	5.31	39.39	92.28	–0.305	细胞质

基因名称Gene name

基因IDGene ID

氨基酸数目Number of amino acid/aa

分子量Molecular weight/Da

等电点Theoretical pI

不稳定指数Instability index

脂肪族指数Aliphatic index

平均亲水性Grand average of hydropathicity

定位Location

CaNMT1c

Chr1c006347

252

28 575.75

8.11

53.86

75.44

–0.297

细胞质

CaNMT2c

Chr1c006370

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5.38

54.07

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–0.246

细胞质

CaNMT3c

Chr1c006565

107

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5.51

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88.60

–0.277

细胞质

CaNMT4c

Chr1c006566

192

21 514.33

5.62

54.53

89.38

–0.152

叶绿体

CaNMT5c

Chr1c006585

130

14 554.80

8.60

30.79

87.85

–0.188

细胞质

CaNMT6c

Chr2c011551

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细胞质

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–0.168

细胞质

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Chr9c039878

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–0.101

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CaNMT10c

Chr9c039881

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CaNMT11c

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CaNMT12c

Chr9c039886

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CaNMT13c

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细胞质

CaNMT15e

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CaNMT19e

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叶绿体

CaNMT20e

Chr2e053130

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细胞质

CaNMT21e

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CaNMT23e

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385

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CaNMT24e

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241

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细胞质