热带作物学报

引物名称Primer name	引物序列（5'-3'）Primer sequence (5'-3')
FoSP1-AF	GCATTCGAATAGACGCTCCG
FoSP1-AR	CTCCTTCAATATCAGTTAACGGAACGTTATGGAGCTCTGC
FoSP1-BF	GTCCGAGGGCAAAGGAATAGGTGCTTGGCCTTGAGGAGTA
FoSP1-BR	AGGGATCCCAGTCGCTTTTG
HYF	TATCGGCACTTTGCATCGGC
YGR	GGATGTTGGCGACCTCGTAT
HygF-pCT74	ATTGCGCGTACAGAACTCCT
HygR-pCT74	ACGTTAACTGGTTCCCGGTC
FoSP1-insideF	TGCGCAAACATATCCCTCGT
FoSP1-insideR	ACGGCCCAGATCCTTAGACT
FoSP1-outsideF	TCCAACTAAACCACCATCGGT
FoSP1-outsideR	GTCTCTTTAGAATGCCAGCAGC
FoSP1-KL-F	ATGCATCTTAAAGCAACCATCGC
FoSP1-KL-R	TTAATTACGGCCCAGATCCTTAGA

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FoSP1-AR	CTCCTTCAATATCAGTTAACGGAACGTTATGGAGCTCTGC
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FoSP1-KL-R	TTAATTACGGCCCAGATCCTTAGA

香蕉枯萎镰刀菌4号生理小种FoSP1基因功能的初步分析

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赵久娟 ¹^,² , 李敏 ¹ , 胡美姣 ¹ , 杨锦玉 ¹^,³ , 何颖 ¹^,⁴ , 柳志强 ² , 孙进华 ¹^,^*

热带作物学报 | 组学与生物技术 2024,45(7): 1332-1339

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热带作物学报 |组学与生物技术 2024 , 45 (7) : 1332 -1339

香蕉枯萎镰刀菌4号生理小种FoSP1基因功能的初步分析

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赵久娟¹^,², 李敏¹, 胡美姣¹, 杨锦玉¹^,³, 何颖¹^,⁴, 柳志强², 孙进华¹^,^*

作者信息

^1.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海南海口　571101

^2.海南大学生命健康学院，海南海口　570228

^3.海南大学热带农林学院，海南海口　570228

^4.贵州大学精细化工研究开发中心，贵州贵阳　550025

通讯作者:

^* 孙进华（SUN Jinhua），E-mail：Jinhuasun_hk@163.com。

Preliminary Analysis of FoSP1 Gene Function of Fusarium oxysporum f. sp. Cubense Race4

Jiujuan ZHAO¹^,², Min LI¹, Meijiao HU¹, Jinyu YANG¹^,³, Ying HE¹^,⁴, Zhiqiang LIU², Jinhua SUN¹^,^*

Affiliations

^1.Environment and Plant Protection Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, Hainan 571101, China

^2.School of Life and Health Sciences, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China

^3.School of Tropical Agriculture and Forestry, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China

^4.Center for Research and Development of Fine Chemicals, Guizhou University, Guiyang, Guizhou 550025, China

出版时间: 2024-07-25 doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2024.07.004

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摘要

收起

香蕉枯萎病是我国香蕉生产中危害最大，且难以防治的一种真菌病害。由于香蕉枯萎病的影响，我国近年来香蕉种植面积逐年减少，给我国亚热带、热带香蕉产业带来了巨大的经济损失。该病害是由于香蕉的维管束受到病原菌尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense，Foc）入侵而发生，其繁殖速度快，引起香蕉叶片黄化和植株萎蔫。通过比较Foc1号生理小种（Foc1）N2菌株和4号生理小种（Foc4）B2菌株的基因组及转录组序列，筛选出位于基因组特异区间并且表达量较高的分泌蛋白FoSP1。结果表明：FoSP1基因开放阅读框为387 bp，编码129个氨基酸，其信号肽切割位点位于第20~21位氨基酸残基之间，且该蛋白无任何已知的结构域和功能位点，因此推断出FoSP1是一个新的分泌蛋白。为了研究该蛋白在Foc4菌株中的生物学作用，本研究利用split-marker的方法敲除了B2菌株的FoSP1基因，并对获得的正确敲除突变体进行表型分析和致病性测定。结果表明：相比野生型B2菌株，FoSP1基因敲除突变体菌丝的营养生长无显著差异，对NaCl、山梨醇和H₂O₂等外源胁迫均表现不敏感，但敲除突变体的产孢量和分生孢子萌发率显著降低，且对巴西蕉苗的致病力明显减弱。由此推测分泌蛋白FoSP1不参与Foc4菌株B2的营养生长，但在其产孢及致病的过程中发挥着重要作用。此结果为进一步研究Foc4基因组特异区间分泌蛋白的致病机制奠定基础。

关键词

尖孢镰刀菌古巴专化型 / FoSP1 / 分泌蛋白 / 基因敲除 / 致病性

Abstract

收起

Banana Fusarium wilt is a fungal disease which is the most harmful and difficult to control in banana production in China. Due to the influence of banana Fusarium wilt, the banana planting area in China has been decreasing year by year in recent years, which has brought huge economic losses to the subtropical and tropical banana industries in China. The disease occurred because the vascular bundle of banana was invaded by Fusarium oxysporum f. sp. cubense (Foc), and its propagation speed was fast, which caused the yellowing of banana leaves and plant wilting. By comparing the genome and transcriptome sequences of Foc race 1 (Foc1, N2) and race 4 (Foc4, B2), a secreted protein FoSP1 located in the lineage-specific region with high expression was screened out. The results showed that the open reading frame of FoSP1 gene was 387 bp, encoding 129 amino acids, and its signal peptide cleavage site was located between the 20th and 21st amino acid residues, and the protein had no known domain and functional site, so it was inferred that FoSP1 was a new secreted protein. In order to study the biological function of the protein in Foc4 strain, the split-marker method was used to knock out the FoSP1 gene of B2 strain, and the phenotype analysis and pathogenicity determination of the correctly knocked-out mutant were carried out. The results showed that compared with wild-type B2 strain, there was no significant difference in the vegetative growth of FoSP1 gene knockout mutants, and they were insensitive to exogenous stresses such as NaCl, D-sorbitol and H₂O₂, but the conidial yield and germination rate of knockout mutants were significantly reduced, and their pathogenicity to Brazilian banana was significantly weakened. It is inferred that the secreted protein FoSP1 does not participate in the vegetative growth of B2 strain, but plays an important role in the process of sporulation and pathogenicity. This result lays a foundation for further study on the pathogenic mechanism of secreted proteins in the genome lineage-specific region of Foc4.

Key words

Fusarium oxysporum f. sp. cubense / FoSP1 / secreted protein / gene knockout / pathogenicity

引用本文

赵久娟, 李敏, 胡美姣, 杨锦玉, 何颖, 柳志强, 孙进华. 香蕉枯萎镰刀菌4号生理小种FoSP1基因功能的初步分析. 热带作物学报, 2024 , 45 (7) : 1332 -1339 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2024.07.004

Jiujuan ZHAO, Min LI, Meijiao HU, Jinyu YANG, Ying HE, Zhiqiang LIU, Jinhua SUN. Preliminary Analysis of FoSP1 Gene Function of Fusarium oxysporum f. sp. Cubense Race4[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2024 , 45 (7) : 1332 -1339 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2024.07.004

正文

收起

作为香蕉的主产国之一，我国有着悠久的香蕉种植史。目前，香蕉是我国热带地区重要的经济支柱产业之一^[1]。香蕉枯萎病是我国香蕉生产中危害最大，且难以防治的一种真菌病害，由于香蕉枯萎病的影响，我国近年来香蕉种植面积逐年减少，给我国亚热带、热带香蕉产业带来了巨大的经济损失。该病害是由于香蕉的维管束受到病原菌尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense，Foc）入侵而发生。作为一种土传病害，该病原菌可从根系侵入，定殖维管束从而引起香蕉叶片黄化和植株萎蔫。其繁殖速度快，能随带病蕉苗传播扩散，致病力极强，并且能够在土壤中存活几十年^[2]。尖孢镰刀菌古巴专化型有4个生理小种，其中，4号生理小种（Foc4）能够侵染几乎所有品种的香蕉，对香蕉的危害性与毁灭性最大^[3-4]。

分泌蛋白是一类在生物体内合成和加工成熟的多肽，经过细胞膜分泌到胞外，参与对周围环境的感知和生物间的相互作用^[5]。分泌蛋白一般具有4个基本特征，最主要特征是它的氨基酸序列具有N端信号肽序列，其次是分泌蛋白不存在跨膜结构域，不具有将蛋白输送到线粒体以及其他胞内细胞器的预测定位信号序列，并且没有糖基磷脂酰肌醇（Glycosylphosphatidylinositol，GPI）锚定位点^[6]。植物病原真菌的一些分泌蛋白在其致病过程中起着重要的作用。郭立佳等^[7]发现假定分泌蛋白SP10参与Foc4对香蕉致病性的调控；DOEHLEMANN等^[8]研究发现，敲除玉米黑穗病菌分泌蛋白基因pep1的敲除突变体菌株无法正常侵入宿主细胞；SAITOH等^[9]研究结果发现，稻瘟病菌侵染水稻时，分泌蛋白MC69对病原菌侵染菌丝的形成是必需的。

在前期的研究中，本研究团队基于三代Pacbio CCS测序技术组装完成了Foc1（菌株编号：N2）和Foc4（菌株编号：B2）T2T完整基因组（结果待发表）。通过比较二者染色体DNA序列，在Foc4菌株的1号染色体的末端鉴定到Foc4菌株特有而Foc1菌株缺失的约1 Mb大小的基因组特异区间（Lineage-specific genomic region，LSGR）。进一步分析发现，该基因组特异区间相对于染色体其它区域，预测的分泌蛋白（N端带信号肽且无跨膜结构域）显著富集。结合转录组测序，从中选择1个具有一定表达值且富含半胱氨酸（含量为8.5%）的分泌蛋白Foc4_01G021900.1作为研究对象，命名为FoSP1。本研究采用split-marker方法对FoSP1基因进行敲除，通过比较突变体与野生型的表型和致病力差异，明确分泌蛋白FoSP1在B2菌株中的生物学功能，以期为研究基因组特异区间分泌蛋白的致病机制提供新的方向和思路。

1　材料与方法

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1.1　材料

1.1.1　供试香蕉品种

巴西蕉（Musa sp. AAA）试管苗由中国热带农业科学院组织培养中心提供。试管苗经沙床炼苗1个月，后移栽到椰糠和砂土1∶1的基质上。待蕉苗达5~6叶龄，且株高20~30 cm时进行接种试验。

1.1.2　菌株、质粒

Foc4 B2菌株及质粒pCT74［含潮霉素磷酸转移酶基因（hyg）］均由本实验室保存。

1.1.3　引物设计

从测序结果中查找并提取FoSP1基因及其上、下游1500 bp的碱基序列，根据目的基因上、下游基因序列以及hyg的碱基序列，设计构建基因敲除融合片段所需的PCR引物和目的基因内、外部验证引物，该引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表1。

1.1.4　试剂、酶及培养基

潮霉素B（Hygromycin B，50 mg/mL）、氨苄青霉素（Amp）、溶壁酶、蜗牛酶、高保真酶、MightyScript第一链cDNA合成Master Mix及50×TAE电泳缓冲液及DNA marker均购于生工生物工程（上海）股份有限公司；多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（离心柱型）、2×Taq PCR Master Mix及真菌基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）均购于天根（北京）生化科技有限公司；普通质粒小提试剂盒（离心柱型）购于Omega Bio-Tek公司；山梨醇（D-Sorbitol）购于北京索莱宝生物技术有限公司；2×A8 Fast-HiFi PCR MasterMix购于北京艾德莱生物科技有限公司；胶回收试剂盒（TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0）购于宝日医生物技术（北京）有限公司；其他具体试剂详见试验步骤。试验所用培养基包括PDA培养基、TB3液体培养基、TB3固体培养基、LB液体培养基、LB固体培养基、CM培养基、MM培养基和CZAPEK培养基等。

1.2　方法

1.2.1　pCT74质粒DNA的提取

将质粒pCT74转移至DH5α中，培养后接入LB固体培养基，挑取单菌落接种于3 mL含有Amp抗性的LB液体培养基中，37 ℃、250 r/min振荡培养12 h左右。随后将菌液转移至1.5 mL离心管，12 000 r/min离心1 min，保留沉淀。参照普通质粒小提试剂盒的方法提取质粒DNA，并对其进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.2　B2菌株基因组DNA的提取

将野生型菌株B2接种到装有100 mL PDB培养基的锥形瓶中，180 r/min、28 ℃摇床振荡培养3 d，3层擦镜纸过滤收集菌丝，按照植物基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA。

1.2.3　目的基因的克隆

根据B2菌株基因组注释的信息获取目的基因的全长序列信息。采用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒提取B2菌株总RNA，然后利用MightyScript第一链cDNA合成Master Mix合成cDNA。根据基因序列设计引物（表1），以B2菌株cDNA为模板，对目的基因进行PCR扩增，获得的PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测出条带单一且大小正确的条带后测序，将得到的测序结果与目的基因的原始序列分别在NCBI网站上进行BLAST比对，确定序列的正确性。

1.2.4　 FoSP1基因敲除融合片段的构建

以提取的B2基因组DNA为模板，FoSP1-AF/FoSP1-AR和FoSP1-BF/FoSP1-BR为引物分别对FoSP1基因上、下游序列进行PCR扩增；以提取的pCT74质粒DNA为模板，HygF-pCT74/HygR-pCT74为引物对hyg基因序列进行PCR扩增。split-marker重叠PCR扩增时分别以FoSP1基因上游PCR扩增产物（A臂）和hyg基因PCR扩增产物为模板，FoSP1-AF/YGR为引物；以FoSP1基因下游PCR扩增产物（B臂）和hyg基因PCR扩增产物为模板，HYF/FoSP1-BR为引物进行PCR扩增。所有PCR过程选择适宜的退火温度及延伸时间，优化PCR程序条件，对得到的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.5　原生质体的制备与转化

B2菌株在PDA固体培养基上培养3 d后，挑取菌丝在PDB液体培养基中摇培2 d，收集孢子悬浮液转移至新的PDB液体培养基中培养18 h，过滤，收集菌丝并用0.7 mol/L NaCl冲洗2遍。挑取菌丝加入酶解液（含10 mg/mL溶壁酶和20 mg/mL蜗牛酶），90 r/min摇床裂解3 h。用1×STC调整原生质体浓度为5×10⁷~5×10⁸个/mL。将原生质体（200 μL）和上、下游PCR重叠片段（各10 μL）混匀，冰上静置30 min，逐滴加入1 mL 40% PTC，轻摇混匀，室温下静置20 min。原生质体用加有5 μL Amp的5 mL TB3液体培养基进行转化，28 ℃、50 r/min振荡培养12 h。将菌液和含hyg抗性的TB3下层固体培养基混匀，倒平板，28 ℃培养12 h，倒入含hyg的TB3上层培养基，28 ℃培养2~5 d。

1.2.6　 FoSP1敲除突变体的筛选与验证

挑取转化子于含hyg的PDA平板，28 ℃培养5 d，刮取菌丝提取基因组。以提取的转化子基因组DNA及野生型B2基因组DNA为模板，FoSP1-outsideF/FoSP1-outsideR作引物进行PCR正筛，FoSP1-insideF/FoSP1-insideR作引物进行PCR负筛，并对得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，只有正、负筛选扩增出的条带均符合预期结果的转化子才能被确定为正确的敲除突变体。

1.2.7　敲除突变体营养生长表型分析

取野生型菌株和敲除突变体直径为5 mm的菌饼，分别接种到PDA、CM、MM及CZAPEK培养基上，28 ℃培养5 d，测量菌落直径，每个处理设3个重复。

1.2.8　分生孢子产生及萌发

取野生菌株和敲除突变体直径为5 mm的菌饼，分别加入3 mL无菌水中，震荡悬浮混匀，计算每毫升的孢子数并统计及比较孢子萌发率，每个处理3个重复。

1.2.9　胁迫因子敏感性试验

渗透压胁迫试验：打取直径为5 mm的野生型和敲除突变体的菌饼分别接种于不同浓度NaCl（1、2 mol/L）和山梨醇（1、2 mol/L）的PDA平板上，每个梯度做3个重复，28 ℃培养5 d后观察菌落形态，并拍照记录。过氧化氢耐受性试验：打取直径为5 mm的敲除突变体和野生菌的菌饼，分别接种于含有不同浓度H₂O₂（0.1%、0.25%、0.5%）的PDA平板上，每个梯度3个重复，28 ℃培养5 d后观察菌落直径大小，并拍照记录。

1.2.10　致病性测定

将FoSP1基因野生型菌株和敲除突变体菌株分别接种于100 mL的PDB液体培养基中，180 r/min、28 ℃摇床振荡培养3 d，过滤收集分生孢子并用无菌水重悬，将孢子悬浮液调至10⁶个/mL。野生型菌株与敲除突变体菌株孢子悬浮液分别接种10株巴西蕉幼苗，刺伤根部后每株苗浇50 mL孢子悬浮液，以清水作为对照。30 d后观察外部叶片黄化情况，切开球茎，观察球茎褐变程度，拍照记录并记录幼苗发病级数，病害分级及病情指数计算参照郭立佳等^[10]的方法。数据采用Excel和SPSS软件进行统计分析。

2　结果与分析

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2.1　 FoSP1基因预测编码产物生物信息学分析

本试验克隆出FoSP1基因的全长，其开放阅读框长为387 bp，其蛋白编码129个氨基酸，等电点（pI）为8.29，其中半胱氨酸含量为8.5%。原子总数为1869，蛋白分子式为C₅₉₃H₉₁₁N₁₆₉ O₁₈₂S₁₄，其不稳定指数为51.04，总平均亲水性系数为-0.321，表明该蛋白为亲水蛋白，不具有稳定性。使用TargetP和SingalP软件预测该蛋白为分泌蛋白，其信号肽切割位点位于第20~21位氨基酸残基之间；TMHMM软件预测结果显示，FoSP1蛋白没有跨膜结构域；用big-Pi Predictor软件预测结果显示，该蛋白没有GPI位点；用PROSITE软件分析结果显示，该蛋白无任何已知的结构域和功能位点。因此，FoSP1是一个新的分泌蛋白。

2.2　构建基因敲除线性片段

采用split-marker方法对FoSP1基因进行敲除（图1）。PCR扩增得到1390 bp的潮霉素基因片段以及1297 bp的A臂和1367 bp的B臂；第2轮PCR扩增融合片段A-hyg和hyg-B，分别扩增出2338、2138 bp的DNA条带，经测序，结果与目的条带序列一致，A-hyg和hyg-B敲除线性片段构建成功。

2.3　敲除突变体的PCR鉴定

将FoSP1基因敲除线性片段转化至野生型菌株B2原生质体，后经再生培养及复筛，获得若干转化子，任取其中10个转化子进行PCR鉴定。正筛结果显示，10个转化子均能扩增出1条约1590 bp的目的条带，而野生型菌株基因组DNA扩增出735 bp的目的条带（图2A）；负筛结果显示10个转化子基因组均未扩出条带，野生型菌株B2基因组扩增出1条约416 bp的条带（图2B）。将转化子PCR产物送出测序，测序结果与目的片段序列一致。以上结果表明，所挑选的10个转化子均为FoSP1基因敲除突变体，选取1株用于后续试验，命名为ΔFoSP1。

2.4　基因敲除突变体营养生长表型分析

在4种不同的营养培养基上，突变株ΔFoSP1的菌落形态特征与野生型菌株的菌落形态特征相似（图3A），并且突变株的菌落直径大小与野生型无显著差异（图3B），说明FoSP1蛋白不影响B2菌株的菌落形态和营养生长。

2.5　基因敲除突变体分生孢子的产生及萌发

计算平板菌落生长边缘菌块的孢子产量，结果表明，突变株的分生孢子产量极显著低于野生型菌株（P<0.01），野生型菌株的孢子产量约为9.2×10⁵个/mL，ΔFoSP1的孢子产量约为3.6×10⁵个/mL（图4A）。在分生孢子萌发过程中，突变株的分生孢子萌发率极显著低于野生型（P<0.01）。8 h时野生型菌株的分生孢子萌发率达到70%左右，突变株的萌发率在40%~50%之间（图4B）。综合研究表明，与野生型相比，FoSP1基因敲除突变体产孢量减少、分生孢子萌发率降低，由此可见，FoSP1基因对B2菌株的产孢过程有影响。

2.6　胁迫因子敏感性分析

分别选择在加有不同浓度的NaCl和山梨醇的PDA平板上进行渗透压胁迫试验，28 ℃恒温培养5 d后，敲除突变体和野生型菌株菌落生长情况在加有NaCl和山梨醇的PDA平板上无明显差异。氧化胁迫分别选择在加入不同浓度H₂O₂的PDA平板上进行试验，28 ℃恒温培养4 d后发现，随着H₂O₂浓度的增大，敲除突变体和野生型受到的抑制均呈现不同程度的增强，敲除突变体和野生型菌株生长无明显差异（图5）。说明FoSP1蛋白不参与B2菌株对于外源胁迫压力的适应性。

2.7　基因敲除突变体对巴西蕉的致病性

在巴西蕉幼苗上对ΔFoSP1突变株进行致病性测定。接种培养30 d后观察发现：对照组蕉苗无发病症状，其余蕉苗均呈现不同程度的发病情况；试验组中，接种野生型菌株的蕉苗，大部分叶片出现大面积的黄化现象，部分植株下部叶片已经枯死，纵切球茎后可以观察到其维管束褐化较为严重，发病部位呈黑褐色；接种ΔFoSP1菌株的蕉苗发病程度较轻，植株部分叶片边缘出现黄化，切开球茎后发现其褐化面积较少或者未出现褐化现象（图6A）。病情指数统计结果表明，接种敲除突变体菌株ΔFoSP1的巴西蕉幼苗平均病情指数（30.7）显著低于野生型菌株B2（51.7）（图6B，P<0.05）。由此可见，敲除FoSP1基因导致B2菌株对巴西蕉的致病性减弱。

3　讨论

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近年来，植物真菌全基因组序列的解析为植物病原的分泌蛋白组提供了重要的研究基础。于钦亮等^[11]基于生物信息学的方法对禾谷镰刀菌（F. graminearum）全基因组进行信号肽分析，预测出606个潜在的分泌蛋白编码基因，其中有79个分泌蛋白具有可预测的功能性描述。MA等^[12]以镰刀菌属中3个不同寄主范围的生理小种，包括禾谷镰刀菌、轮枝镰刀菌（F. verticillioides）和尖孢镰刀菌番茄专化型（F. oxysporum f. sp. Lycopersici）为研究对象，对其分泌蛋白组进行差异比较，发现了强毒菌株特有的4条谱系特异性（LS）基因组区域的LS染色体可将弱毒株转化为强毒株，LS染色体中含有大量的激发子类和细胞壁降解酶类分泌蛋白基因，从而证明分泌蛋白类群在镰刀菌生物学毒性中起重要作用。黄影华^[13]通过基因组和转录组测序的方法对菌株Foc TR4-14013进行全基因组表达量测定，并通过对所选的5个分泌蛋白进行基因克隆、基因敲除和致病性分析，首次对其功能进行了研究。病原真菌分泌蛋白的研究进展，一方面增进了对病原真菌分泌蛋白的分泌机制的了解，另一方面进一步阐明了病原真菌对植物的致病过程^[11]。真菌的分泌蛋白分子量一般较小，半胱氨酸含量较高。在尖孢镰刀菌SIX家族蛋白质中，所有SIX6分泌蛋白均具有8个保守的半胱氨酸残基，其中1个位于信号肽中^[14]；Foc菌株中flh2基因编码蛋白的半胱氨酸含量占总氨基酸序列的3%^[6]。本研究的FoSP1蛋白与该研究相比，半胱氨酸含量更高，为8.5%，因此具有分泌蛋白的特性。本研究中，FoSP1基因敲除突变菌株ΔFoSP1的营养生长、菌落形态特征均未产生明显变化，这表明其不参与Foc4 B2菌株营养生长过程的调控。分生孢子是大多数真菌的无性繁殖方式，对真菌形成侵染循环至关重要^[15]。镰刀菌在孢子萌发后形成菌丝体，可侵染作物根尖或新鲜伤口组织，在寄主体内繁殖并产生大量的致病性相关分泌物^[16]。魏晨星^[17]研究发现Foc4菌株FoCaMK基因敲除突变体生长速率及菌落形态与野生型菌株相比无显著差异，但产孢量明显降低，致病性显著降低；聂燕芳等^[18]的研究表明，Foc4菌株敲除突变体ΔFoupe1的菌丝和孢子形态无明显差异，并且对NaCl、山梨醇胁迫不敏感，但菌株菌落生长和产孢量显著下降，并且对巴西蕉的致病力显著降低；GUO等^[19]发现Fosp9基因敲除突变体可能对真菌生长和发育无影响，且对渗透胁迫的耐受性、细胞壁降解酶的分泌无影响，本研究结果与其相似。

综上所述，FoSP1蛋白是一个新的分泌蛋白，使用split-marker基因敲除获得了FoSP1敲除突变菌株，通过分析FoSP1基因敲除菌株表型和致病性的变化，初步揭示FoSP1蛋白参与尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种B2的产孢、孢子萌发及其对香蕉致病性的调控。此结果为进一步研究基因组特异区间分泌蛋白在尖孢镰刀菌致病过程的作用奠定了良好基础。

基金

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海南省自然科学基金项目(320RC696)
国家自然科学基金项目(31872088)
农业农村部财政专项(NFZX-2021)

参考文献

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文献

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排序方式：

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2024年第45卷第7期

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文章信息

doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2024.07.004

接收时间：2023-10-22
首发时间：2026-06-24
出版时间：2024-07-25

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作者

出版历史

收稿日期：2023-10-22
修回日期：2023-11-09

基金

海南省自然科学基金项目(320RC696)

国家自然科学基金项目(31872088)

农业农村部财政专项(NFZX-2021)

作者信息

^1.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海南海口　571101

^2.海南大学生命健康学院，海南海口　570228

^3.海南大学热带农林学院，海南海口　570228

^4.贵州大学精细化工研究开发中心，贵州贵阳　550025

通讯作者:

^* 孙进华（SUN Jinhua），E-mail：Jinhuasun_hk@163.com。

参考文献

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/rdzwxb/CN/10.3969/j.issn.1000-2561.2024.07.004

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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