热带作物学报

基因Gene	引物名称Primer name	引物序列（5′-3′）Primer sequence (5′-3′)
ITS	ITS1	TCCGTAGGTGAACCTGCGG
ITS4	TCCTCCGCTTATTGATATGC
TUB2	Bt2a	GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC
Bt2b	ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC
CHS-1	CHS-79F	TGGGGCAAGGATGCTTGGAAGAAG
CHS-354R	TGGAAGAACCATCTGTGAGAGTTG
ACT	ACT-512F	ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC
ACT-783R	TACGAGTCCTTCTGGCCCAT
GAPDH	GDF1	GCCGTCAACGACCCCTTCATTGA
GDR1	GGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGT

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组分Component	体积Volume/μL	终浓度Final concentration
10×ThermoPol buffer	2.5	1×
MgSO₄（100 mmol/L）	1.5	6 mmol/L
dNTP Mix（10 mmol/L）	3.5	1.4 mmol/L
Bst DNA polymerase large fragment	1.0	320 U/mL
甜菜碱（20 mmol/L）	1.0	0.8 mmol/L
FIP/BIP primers（10 μmol/L）	4.0	1.6 μmol/L
F3/B3 primers（10 μmol/L）	0.5	0.2 μmol/L
DNA模板	2.0
Nuclease-free water	1.5

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Tub-L2	2-F3	GCGCATGATCGTCTACTTCA	20
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Tub-CS-L	1-F	CCCACAGTGCAAGATAAACA	20
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菌株Strain	采集地点Collection location	菌株Strain	采集地点Collection location
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TYH-2	兴隆太阳河基地	LY-5	兴隆隆苑咖啡庄园
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TYH-4	兴隆太阳河基地	GY-1	兴隆咖啡公园
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海南万宁咖啡炭疽病菌Colletotrichum siamense的分离鉴定及LAMP快速检测体系的建立

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温思为 , 高圣风 , 田甜 , 刘世超 , 苟亚峰 , 张若男 , 薛超 ^* , 孙世伟 ^*

热带作物学报 | 植物保护与生物安全 2025,46(7): 1733-1744

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热带作物学报 |植物保护与生物安全 2025 , 46 (7) : 1733 -1744

海南万宁咖啡炭疽病菌Colletotrichum siamense的分离鉴定及LAMP快速检测体系的建立

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温思为（1998—），女，硕士，研究实习员，研究方向：咖啡病虫害防治。

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温思为（1998—），女，硕士，研究实习员，研究方向：咖啡病虫害防治。

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温思为, 高圣风, 田甜, 刘世超, 苟亚峰, 张若男, 薛超^*, 孙世伟^*

作者信息

中国热带农业科学院香料饮料研究所/海南省热带香辛饮料作物遗传改良与品质调控重点实验室/农业农村部香辛饮料作物遗传资源利用重点实验室，海南万宁　571533

通讯作者:

^* 薛超（XUE Chao），E-mail：cxue8716@163.com

孙世伟（SUN Shiwei），E-mail：sunshw@126.com。

Isolation, Identification of Colletotrichum siamense Causing Coffee Anthracnose in Wanning, Hainan, and Development of a Rapid LAMP Detection System

Siwei WEN, Shengfeng GAO, Tian TIAN, Shichao LIU, Yafeng GOU, Ruonan ZHANG, Chao XUE^*, Shiwei SUN^*

Affiliations

Institute of Spice and Beverage Research, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Hainan Provincial Key Laboratory of Genetic Improvement and Quality Regulation for Tropical Spice and Beverage Crops / Key Laboratory of Genetic Resource Utilization of Spice and Beverage Crops, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Wanning, Hainan 571533, China

出版时间: 2025-07-25 doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.07.020

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摘要

收起

作为海南省万宁市特色农业支柱产业，兴隆咖啡产业的可持续发展正面临炭疽病侵害的严峻挑战。咖啡炭疽病可导致咖啡叶片焦枯、枝条溃疡及浆果褐腐，是咖啡的主要病害之一。本研究在万宁咖啡主产区采集咖啡炭疽病样品并分离病原菌，通过ITS、TUB2、CHS-1、ACT、GAPDH多基因联合分析鉴定病原菌，并基于环介导等温扩增技术（LAMP）建立快速检测体系。结果表明：（1）采集典型病样50份，经组织分离纯化获得炭疽菌株24株；（2）明确万宁5个种植区的病原种群结构包含4个炭疽菌种，即Colletotrichum tropicale、C. karstii、C. fructicola及优势种暹罗炭疽菌（C. siamense，45.8%）。（3）基于TUB2基因特异区域，设计筛选得到特异性LAMP引物组Tub-L1，优化反应体系参数为63 ℃恒温扩增50 min，内外引物浓度比为8∶1，Mg²⁺ 8 mmol/L，dNTPs 0.8 mmol/L，无需甜菜碱。验证试验表明，该体系检测灵敏度达100 pg/µL（为常规PCR的10倍）；对炭疽菌属的7个近缘种（C. tropicale、C. fructicola、C. karstii等）及7种非靶标植物病原菌[含咖啡驼孢锈菌（Hemileia vastatrix）、菜豆间座壳菌（Diaporthe phaseolorum）等]均无阳性反应。采用优化后的LAMP检测体系对田间采集的病害叶片样本进行分析，所有样品均成功检测出暹罗炭疽菌，其结果与常规PCR检测方法一致。综上所述，本研究建立并优化的咖啡炭疽病菌LAMP快速检测体系具有操作简便、反应高效、特异性强、灵敏度高以及结果可视化等优势，适用于暹罗炭疽菌（C. siamense）的田间快速检测。该体系为咖啡炭疽菌的精准鉴定及高效检测提供了可靠的技术支撑，对咖啡炭疽病的早期预警、病害监测及综合防控具有重要的实践意义和应用价值。

关键词

咖啡炭疽病 / 病原鉴定 / 环介导等温扩增（LAMP） / 检测

Abstract

收起

Xinglong coffee, a pillar of the local characteristic agriculture in Wanning, faces severe threats to its sustainable production from anthracnose. This disease can cause leaf scorching, branch ulcers, and berry brown rot, making it one of the major diseases in the industry. In this study, samples of coffee anthracnose were collected from the main coffee-growing areas in Wanning and the pathogenic fungi were isolated. The pathogenic fungi were identified through the combined analysis of multiple genes, including ITS, TUB2, CHS-1, ACT and GAPDH. Furthermore, a rapid detection system based on the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technique was established. 50 typical disease samples were collected, and through tissue separation and purification, a total of 24 Colletotrichum isolates were obtained. The pathogen population structure in the five planting areas of Wanning was clarified to comprise four species of Colletotrichum spp.: C. tropicale, C. karstii, C. fructicola, and the dominant species was C. siamense (accounting for 45.8%). Based on the specific region of TUB2, a specific LAMP primer set (Tub-L1) was designed and screened. The optimized reaction parameters were established as follows: isothermal amplification at 63 ℃ for 50 minutes, outer-inner primer concentration ratio of 8∶1, Mg²⁺ 8 mmol/L, dNTPs 0.8 mmol/L, and without the need for betaine. Validation experiments demonstrated that the detection sensitivity of this system reached 100 pg/μL (10 times higher than conventional PCR). Furthermore, the system showed no positive reactions to seven closely related species within Colletotrichum spp. (including C. tropicale, C. fructicola, C. karstii) or seven non-target plant pathogens [including Hemileia vastatrix (coffee leaf rust), Diaporthe phaseolorum, and others]. Using the optimized LAMP detection system, the diseased leaf samples collected from the field were analyzed. C. siamense was successfully detected in all samples, and the results were completely consistent with those obtained by conventional PCR methods. In summary, the LAMP-based rapid detection system for Colletotrichum sp. established and optimized in this study demonstrates significant advantages, including simplified operation, high reaction efficiency, strong specificity, enhanced sensitivity, and visualizable results, making it highly suitable for field-based rapid detection of C. siamense. This system would provide reliable technical support for the precise identification and efficient detection of coffee anthracnose fungus, and have important practical significance and application value for the early warning, disease monitoring, and integrated control of coffee anthracnose.

Key words

coffee anthracnose / pathogen identification / loop-mediated isothermal amplification (LAMP) / detection

引用本文

温思为, 高圣风, 田甜, 刘世超, 苟亚峰, 张若男, 薛超, 孙世伟. 海南万宁咖啡炭疽病菌Colletotrichum siamense的分离鉴定及LAMP快速检测体系的建立. 热带作物学报, 2025 , 46 (7) : 1733 -1744 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.07.020

Siwei WEN, Shengfeng GAO, Tian TIAN, Shichao LIU, Yafeng GOU, Ruonan ZHANG, Chao XUE, Shiwei SUN. Isolation, Identification of Colletotrichum siamense Causing Coffee Anthracnose in Wanning, Hainan, and Development of a Rapid LAMP Detection System[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2025 , 46 (7) : 1733 -1744 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.07.020

正文

收起

咖啡为茜草科（Rubiaceae）咖啡属（Coffea）的多年生常绿木本植物，作为热带与亚热带地区的关键经济作物，对全球热带农业经济具有重要战略意义。海南地处热带作物优势产区，经过百余年的栽培体系演化，现成为我国中粒种咖啡（Coffea canephora var. robusta）的核心生产区域。万宁市在海南咖啡产业布局中占核心地位，是当前海南省咖啡种植和收获面积最大的产区，其“兴隆咖啡”凭借独特的风味特征和卓越的品质表现，在国内外咖啡市场中享有较高知名度，成功塑造了海南咖啡的地域品牌形象^[1-2]。

咖啡的生长种植过程中易受到多种病原物的侵染，由炭疽菌属（Colletotrichum spp.）引起的咖啡炭疽病是许多咖啡种植国咖啡高质量生产的主要限制因素，我国云南、海南等咖啡种植区均有发现该病为害，且为害程度不断加重^[3]。咖啡炭疽病周年发生，病原菌能够侵染咖啡植株的多个部位，包括嫩叶、枝条以及果实等，引发叶片脱落、枝条枯死、果实腐烂，严重时甚至整株死亡^[4]。例如浆果炭疽菌（Colletotrichum kahawae）对高海拔地区种植的小粒种咖啡（Coffea arabica）造成严重威胁，该病原菌已列入我国进境植物检疫性有害生物名单，该病原菌引起的咖啡浆果病致使非洲地区咖啡浆果产量损失高达80%^[5-7]。咖啡炭疽病的发病率与当地气候条件密切相关。研究表明，气温20 ℃左右、相对湿度90%以上（持续7 h以上）的冷凉高湿环境为该病原菌侵染的最适条件，特别是长期干旱后的连续降雨期间，咖啡炭疽病的发病率与病情指数往往达到最大值，常在9—11月达到峰值^[8-9]。

炭疽菌属真菌广泛分布于热带和亚热带地区。由于其寄主广泛，侵染咖啡的炭疽菌种类呈高度多样性，且优势病原种群分布与地理环境、寄主品种显著相关^[3]。CRISTÓBAL-MARTÍNEZ等^[10]通过多基因系统发育分析对墨西哥小粒种咖啡的炭疽病菌进行研究，鉴定出C. gigasporum、C. siamense、C. karstii、C. gloeosporioides和C. theobromicola五个种。CAO等^[3]在海南5个咖啡种植区（涵盖小粒种与中粒种），共鉴定出8个炭疽菌种，包括C. fructicola、C. siamense、C. tropicale等。目前国内对于咖啡炭疽菌的病原鉴定与检测研究中主要依赖于常规PCR、实时荧光定量PCR（qPCR）、巢式PCR等方法。然而，这些技术存在操作流程复杂、设备要求高等局限性，难以满足田间快速诊断病原的需求。因此，开发一种基于环介导等温扩增技术（LAMP）的高灵敏度、高特异性的快速检测方法，对于实现咖啡炭疽病的早期预警和精准防控具有重要的实践意义。

LAMP是由NOTOMI等^[11]于2000年研发的新型等温核酸扩增技术。该技术具有操作简便（无需热循环仪器）、特异性强、灵敏度高等技术优势，在植物真菌、细菌、病毒的检测等领域得到了广泛应用，显著提升了田间病原物的诊断效率^[12]。马骏^[13]基于比较基因组学筛选出果生炭疽菌（C. fructicola）的特异性分子标记，成功建立了针对山核桃（Carya cathayensis）叶部病原真菌的LAMP快速检测体系，该体系可在接种病原菌72 h后准确检测出山核桃叶片病斑中的病原菌。汪涵^[14]针对甘蔗褐锈病菌（Puccinia melanocephal）和咖啡叶锈病菌（Hemileia vastatrix）ITS基因的保守区域设计特异性引物构建LAMP体系，试验数据显示，该体系对2种病原物的检测效率均高于普通PCR。秦艳红等^[15]以SYBR Green Ⅰ为荧光指示剂，建立了针对地黄花叶病毒（ReMV）的逆转录LAMP（RT-LAMP）体系，阳性检出率达98.3%，远高于常规RT-PCR（75.0%）。

炭疽菌属因种内遗传多样性丰富，受到环境因子、寄主差异等因素的影响，基于表型特征（菌落形态、培养性状及致病性等）的传统分类体系存在稳定性缺陷。本研究以咖啡炭疽病样品为研究对象，开展多位点系统发育分析，明确了暹罗炭疽菌（C. siamense）为咖啡炭疽病的优势致病种，进而针对其β-tubulin（TUB2）基因保守区域设计特异性引物，经反应参数优化、特异性验证及灵敏度检测，系统构建LAMP快速检测体系，以期为咖啡炭疽病的早期诊断与田间预警提供高效检测技术。

1　材料与方法

收起

1.1　材料

1.1.1　供试材料

于2022年对海南省万宁市的3个咖啡种植园与中国热带农业科学院香料饮料研究所的2个试验基地（分别为兴隆热带植物园与大路试验示范基地）开展咖啡病害发生情况的实地调查。在调查过程中，采用随机法、五点取样法，采集具有咖啡炭疽病典型症状（如出现黑点、萎缩病变等）的枝条样本，将其装入样本袋后带回实验室，在4 ℃条件下保存。共采集50份样本进行菌株的分离、纯化。所有分离获得的菌株均保存于中国热带农业科学院香料饮料研究所。

1.1.2　主要试剂

Taq酶、Bst DNA酶以及配套的Buffer、MgSO₄、dNTPs购自南京诺维赞生物科技股份有限公司；甜菜碱（betaine）与荧光指示剂SYBR Green Ⅰ（10 000×）购自索莱宝科技有限公司（北京）；DL2000 DNA marker与DL2000 plus marker购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司。

1.2　方法

1.2.1　多基因联合系统发育鉴定

选取ITS、TUB2、GAPDH、CHS-1、ACT^[16-19]5个保守序列基因位点的通用引物（表1）进行PCR扩增。PCR反应体系总体积为50 μL，包括DNA模板2 μL，2×Taq Master Mix 25 μL，10 μmol/L正反向引物各2 μL，ddH₂O 19 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，循环30次；72 ℃终延伸5 min。PCR扩增结束后，利用1%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测，将产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将获得的测序结果提交至NCBI GenBank进行BLASTn同源性比对，筛选同源性>98%的参考菌株序列。所有供试菌株及参考菌株序列均通过MEGA 7软件的CustalW模块进行多序列比对，利用TBtools 2软件截取过滤低质量位点，最终采用最大似然法（maximum likelihood，ML）构建多基因联合系统发育树（最佳模型：TN93+G，bootstrap：1000）。

1.2.2　LAMP体系的建立与可视化结果

基于LAMP初步反应体系（表2），参照Bst DNA Polymerase Large Fragment说明书设置等温扩增参数：60 ℃恒温反应60 min，80 ℃灭活10 min终止反应。显色检测时加入2 μL SYBR Green Ⅰ（终浓度1×），观察反应溶液的颜色变化。阳性扩增的反应液呈黄绿色荧光，阴性对照保持橙色；同步通过琼脂糖凝胶验证其扩增特异性，阳性产物显示梯形条带，阴性样本无条带。试验全程设立阴性对照（无模板DNA）以确保检测特异性。

1.2.3　LAMP引物设计

基于咖啡暹罗炭疽（C. siamense）菌株TUB2的种内多序列比对结果，寻找序列特异区域。采用Primer Explorer V5（http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html）对保守差异片段进行LAMP引物设计，包括外部引物对F3和B3、内部引物对FIP和BIP、环引物LoopF和LoopB；参照自由能（ΔG≤-4.0 kcal/mol）与GC含量（40%~60%）等条件进行筛选，筛选获得2组候选引物（表3），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物验证同1.2.2，进行荧光显色（SYBR Green I）与琼脂糖凝胶电泳（1%）。针对常规PCR中TUB2通用引物（Bt2a/Bt2b）种间特异性不足的问题，通过Primer Primier 6设计物种特异性TUB2引物，用于后续灵敏度分析及田间样本特异性验证。

1.2.4　LAMP体系反应条件的优化

为确定LAMP反应的最佳温度，设置6个反应温度，分别为54、57、60、63、65、70 ℃，在各设定温度下进行反应。同时，为优化反应时间，选择8个反应时长（20~90 min，间隔10 min）进行对比试验。

在时间与温度优化的基础上，进一步对体系组分进行优化。首先是内外引物配比优化，设定内外引物比分别为8∶1、6∶1、4∶1、2∶1；鉴于Mg²⁺浓度影响DNA聚合酶活性，试验分别设置2、3、4、6、8、10、12 mmol/L Mg²⁺浓度梯度。而dNTPs作为扩增反应的原料，优化其浓度（测试浓度为0~1.6 mmol/L，以0.2 mmol/L递增），避免因其过少限制扩增效率或过多导致非特异性扩增。此外，甜菜碱能够促进DNA解链并减少二级结构的产生，在LAMP反应中作为辅助剂，通过0~1.6 mmol/L（间隔0.2 mmol/L）浓度梯度进行甜菜碱的用量优化。分析流程参照1.2.2。

1.2.5　LAMP体系灵敏度与特异性验证

将已知浓度为10 ng/μL的咖啡炭疽菌DNA模板进行系列稀释，设置浓度梯度为10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL、100 ag/μL，将不同浓度的模板加入体系中进行反应，以确认该体系的最低检测限。在特异性验证中，选取咖啡叶片以及已鉴定的7种植物病原菌：黑孢菌（Nigrospora oryzae）、菜豆间座壳菌（Diaporthe phaseolorum）、茄腐镰刀菌（Fusarium solani）、咖啡驼孢锈菌（Hemileia vastatrix）、咖啡尾孢菌（Cercospora coffeicola）、线浅孔菌（Grammothele lineata）、首都叶点霉（Phyllosticta capitalensis）。提取上述样品DNA加入LAMP体系中进行扩增，同时结合常规PCR扩增靶标基因进行测序。分析方法同1.2.2。

1.2.6　优化后的LAMP体系对田间咖啡病原物的检测

提取田间采集疑似炭疽病感染的咖啡病叶组织DNA，并将其作为模板引入优化后的LAMP检测体系中进行扩增，同时加入非炭疽菌样品进行检测。分析方法同1.2.5。

2　结果与分析

收起

2.1　炭疽病样本采集及病原菌分离

田间调查表明，在5个咖啡种植园中，均为中粒种咖啡呈现明显感病性（图1）。炭疽病侵染叶片呈现多阶段病理特征：初期叶表出现黄褐色至黑褐色坏死斑；进展期病斑扩展，边缘可见暗褐色同心轮纹；后期症状严重，发展为带有黑色脓肿同心环的凹陷坏死病变。该病表现出全生育期侵染特性，在营养生长期、果实发育期均可造成典型病症。

对采集的病叶样本进行组织分离，共分离纯化获得24个炭疽菌株，其地理分布信息见表4。在PDA培养基上，各菌株菌落均呈现典型形态特征：菌落直径35~48 mm（培养第5天），中央区域为棉絮状白色菌丝体，边缘呈波状或纤毛状扩展，并逐渐过渡为灰色至炭黑色，难以依据菌落形态学特征进行分组，部分菌落形态见图2。

2.2　多基因联合鉴定结果

采用MEGA软件构建基于最大似然法（maximum likelihood，ML）的系统发育树，对目标基因序列进行多序列比对及修剪。分析的基因片段顺序及长度如下：ITS（1~502 bp）、TUB2（503~885 bp）、CHS-1（886~1076 bp）、ACT（1077~1289 bp）、GAPDH（1290~1475 bp）。24株炭疽病菌被划分为C. tropicale、C. karstii、C. fructicola、C. siamense 4个类群（图3）。其中，C. siamense分支包含11个菌株（占总数的45.8%），且该分支菌株广泛分布于5个采样地点，显示出显著的地理分布优势。

2.3　LAMP体系引物的筛选

基于TUB2基因保守区设计的LAMP引物特异性评估显示，Tub-L1引物有且仅对C. siamense产生典型LAMP扩增特征，而其余7个炭疽菌属菌株样品（包括C. fructicola、C. gloeosporioides等）均未检测到特异性扩增条带（图4A、图4B）；Tub-L2引物组在2号（C. siamense）和4号（C. fructicola）样本中引发特异性扩增（图4C、图4D）。基于试验效率及引物特异性验证，最终选定Tub-L1引物（图5）作为后续检测体系的试验引物。

2.4　LAMP体系的优化

2.4.1　LAMP体系温度与反应时间优化

如图6所示，LAMP扩增体系在60~65 ℃的温度范围内均能实现特异性扩增，均呈现明显的黄绿色阳性显色反应，其中63 ℃条件下扩增产物的电泳条带最清晰，表明该温度为最适反应温度。

基于上述温度参数，通过时间梯度试验进一步优化，结果表明，40 min反应体系就可检测到典型梯形条带，其扩增效率与90 min组无明显差异（图7）。鉴于LAMP技术快速检测的特性，综合检测灵敏度与时效性，选择50 min作为标准反应时间。对于低拷贝样本，建议适当延长反应时间至60 min以提高产物积累量，此时体系仍能保持良好扩增特异性。

2.4.2　LAMP体系各组分最适浓度筛选

通过引物浓度配比试验发现，当体系内外引物比（F3/B3∶FIP/BIP）为2∶1时无扩增条带，而4∶1、6∶1、8∶1组均能产生特异性扩增产物；经琼脂糖凝胶电泳分析，8∶1组扩增条带亮度明显高于其他组（图8），故维持初始引物浓度比（8∶1）。

针对Mg²⁺浓度的梯度试验表明，4~8 mmol/L范围内均能实现靶标扩增，其中8 mmol/L组扩增效率最高，产物梯形条带亮度明显（图9）。dNTPs浓度优化结果显示，0.8~1.8 mmol/L浓度区间均可完成有效扩增，但0.8 mmol/L浓度扩增效率与高浓度组无明显差异（图10），且低浓度的dNTPs能有效降低焦磷酸镁沉淀风险。

甜菜碱浓度（0.8~1.6 mmol/L）的梯度试验表明，其浓度变化对扩增效率及产物积累量无明显影响（图11），证实该体系对甜菜碱无依赖性。基于成本效益分析，最终确立TUB2靶标检测咖啡炭疽菌的优化体系为：8 mmol/L Mg²⁺、0.8 mmol/L dNTPs，且无需添加甜菜碱。

2.4.3　LAMP体系反应灵敏度与特异性验证

对梯度稀释模板进行灵敏度验证显示，该体系检测限为100 pg/μL，模板浓度为10 pg/μL时无条带（图12）。值得注意的是，常规PCR在相同模板浓度（1 ng/μL）下仅产生微弱条带，而100 pg/μL时完全无扩增结果，证实LAMP的灵敏度较PCR至少提升1个数量级。

采用7种植物病原菌及健康咖啡叶片DNA进行特异性验证，如图13所示，SYBR Green Ⅰ荧光染色显示仅咖啡暹罗炭疽菌（C. siamense）反应体系呈现黄绿色荧光，其余样本均保持橙色本底。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进一步证实，仅目标菌株出现阶梯状条带，空白对照与其他病原菌均无扩增条带。综合2.3引物筛选结果及上述试验结果表明，本研究建立的咖啡炭疽菌C. siamense LAMP反应体系具有高度特异性。

2.4.4　LAMP体系检测田间病原菌

结果如图14所示，田间采集的12份咖啡病叶样本经LAMP检测显示，样品2、4、5反应体系出现明显黄绿色显色反应，琼脂糖凝胶电泳可见清晰梯形条带；其余7份均保持橙色，电泳无扩增条带。同步进行的PCR验证试验（引物Tub-CS-L）表明，阳性样本2、4、5在173 bp处出现特异性条带，与LAMP检测结果一致。研究证实优化后的LAMP体系可成功检测田间样本中的咖啡暹罗炭疽菌（C. siamense），且检测周期较常规PCR缩短62%（LAMP为50 min，PCR为130 min），满足田间样本快速、精准的检测需求。

3　讨论

收起

作为植物病原真菌的重要类群之一，炭疽菌属真菌对多种具有重要经济价值的热带作物（特别是水果和观赏植物）造成严重危害，包括咖啡、胡椒、橡胶、菠萝蜜等^[20-23]。其中暹罗炭疽菌（C. siamense）最初常被误鉴定为胶孢炭疽菌（C. gloeosporioides），后经学者系统修订，确认为独立物种^[24]。本研究基于多基因系统发育分析方法，对24株咖啡炭疽菌分离株进行分离鉴定，其中11株鉴定为暹罗炭疽菌（占分离株总数的45.8%），且分布最广，为优势种群。这一结果与前期研究一致，如巩佳莉^[25]从云南、海南收集的74株咖啡炭疽菌中鉴定出7个炭疽菌种，其中暹罗炭疽菌占比最高（32%）；陆英等^[26]对55株咖啡炭疽病菌的分类研究也显示暹罗炭疽菌为优势种，占比达43.64%。值得注意的是，暹罗炭疽菌不仅是海南咖啡、橡胶和槟榔3种重要热带作物的主要病原菌，且因其在寄主间具有交叉感染能力，加之海南多年连作或相邻种植的栽培模式，导致该病原菌潜伏感染的风险加剧，严重阻碍了田间咖啡炭疽病害的有效防控^[27]。因此，建立基于LAMP技术的早期检测体系，结合病原菌种群动态监测，对实施精准防控和降低咖啡炭疽病流行风险具有重要的实践价值。

LAMP技术是基于特异性引物的多重识别机制，通过设计4~6条靶向基因保守区的引物实现高精度扩增，其特异性源于引物与靶标序列的严格互补匹配，若存在核苷酸错配或缺失，则扩增无法进行，从而确保检测的高度特异性。相较于传统PCR技术对热循环仪器的依赖，LAMP技术因其恒温扩增特性，简化了试验流程并降低了设备需求；同时，该技术兼具扩增效率高、结果可视化等优点，因此更适用于基层实验室或资源受限场景的快速检测需求^[12,28]。

LAMP技术的关键核心在于靶标基因的精确筛选，需优先选择种内高保守，且种间多态性显著的基因区段。除常规应用的ITS、TUB2基因外，近年相关研究拓展至16S rDNA、CYP51C、CYP450等基因位点^[29-31]。如王贤达等^[32]基于葡萄炭疽病菌（C. gloeosporioides）的ITS特异区域构建的LAMP体系，该体系对葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、桃褐腐病菌（Monilinia laxa）等菌株无扩增反应。ARAVINDARAM等^[33]基于辣椒炭疽菌（C. capsici）的TUB2基因构建了LAMP体系，该体系对菜豆壳球孢菌（Macrophomina phaseolina）、胶孢炭疽菌（C. gloeosporioides）、腐皮镰刀菌（Fusarium solani）等8种病原菌均无扩增。王冠华^[34]开发了苹果炭疽病菌（C. gloeosporioides）TUB靶向检测体系，该体系对苹果斑点落叶病菌（Alternaria alternaria）、苹果霉心病菌（Trichothecium roseum）等常见病原体具有严格特异性。本研究以TUB2特异性区域序列为靶标，设计LAMP特异性引物组。通过验证试验表明，该体系对黑孢菌（Nigrospora oryzae）、咖啡驼孢锈菌（Hemileia vastatrix）等7种非靶标菌株无扩增反应，同时对炭疽属内7个近缘种（C. tropicale、C. fructicola、C. karstii等）亦无交叉反应。此外，对照试验进一步排除了咖啡叶片基因组DNA对检测结果的潜在干扰，证实了该LAMP检测体系的特异性与可靠性。

LAMP反应产物的可视化检测常采用荧光指示剂，如利用SYBR Green Ⅰ、钙黄绿素-锰离子复合物、羟基萘酚蓝（HNB）等进行验证。研究表明，HNB与SYBR Green Ⅰ的检测灵敏度显著优于其他指示剂；然而，HNB的显色机制依赖于反应过程中焦磷酸镁沉淀导致的pH变化，其浓度需精确调控，浓度过高会抑制Bst DNA聚合酶活性^[13]。本研究选择SYBR Green Ⅰ作为指示剂，其双链DNA结合特性可实现扩增终产物的即时荧光检测，但传统开盖加样操作易产生气溶胶污染，需严格执行分区操作（样本处理区、扩增区、检测区的物理隔离）并配合紫外臭氧灭菌。为规避污染风险，可借鉴闭管检测策略，即把SYBR Green Ⅰ预加至PCR管盖内壁，扩增结束后通过高速离心实现染料与反应液的充分混合，该方法可有效降低假阳性率^[35]。

病原物检测体系的灵敏度是决定田间早期诊断效能的重要参数。本研究建立的咖啡炭疽病菌暹罗炭疽菌（C. siamense）LAMP体系，经梯度稀释模板验证，其最低检测限为100 pg/μL。该灵敏度与已报道的向日葵核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）^[36]、余甘子果实斑点病菌（Diaporthe phoenicicola）^[37]等体系相当。不同研究体系间其灵敏度存在差异，王贤达等^[32]基于葡萄炭疽病设计的检测体系灵敏度达500 fg/μL，汪少丽等^[35]基于苹果炭疽菌基因构建的LAMP体系其灵敏度突破至1 ag/μL，灵敏度的差异可能与靶标基因拷贝数、核酸纯化方法有关。尽管本体系的灵敏度处于中等水平，但仍优于常规PCR技术。

病原菌的精准快速鉴定是咖啡炭疽病综合防控体系的核心环节，直接影响病害预警的时效性及防控决策的科学性。本研究基于暹罗炭疽菌（C. siamense）的TUB2基因特异区域，成功构建了基于比色变化、快速精确的LAMP检测体系。该体系的建立突破了传统培养鉴定法周期长、分子检测依赖精密仪器等的技术瓶颈，为咖啡炭疽病的早期诊断及其精准防控策略的实施提供技术支撑，同时为咖啡的抗病育种及综合防治提供理论依据，也为农业生产上其他病害的快速诊断提供重要参考。

基金

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海南省自然科学基金项目(321QN329)
国家现代农业产业技术体系项目(CARS-11)

参考文献

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文献

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2025年第46卷第7期

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doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.07.020

接收时间：2025-02-12
首发时间：2026-06-24
出版时间：2025-07-25

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作者

出版历史

收稿日期：2025-02-12
录用日期：2025-03-21

基金

海南省自然科学基金项目(321QN329)

国家现代农业产业技术体系项目(CARS-11)

作者信息

通讯作者:

^* 薛超（XUE Chao），E-mail：cxue8716@163.com

孙世伟（SUN Shiwei），E-mail：sunshw@126.com。

参考文献

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/rdzwxb/CN/10.3969/j.issn.1000-2561.2025.07.020

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

基因Gene	引物名称Primer name	引物序列（5′-3′）Primer sequence (5′-3′)
ITS	ITS1	TCCGTAGGTGAACCTGCGG
ITS4	TCCTCCGCTTATTGATATGC
TUB2	Bt2a	GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC
Bt2b	ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC
CHS-1	CHS-79F	TGGGGCAAGGATGCTTGGAAGAAG
CHS-354R	TGGAAGAACCATCTGTGAGAGTTG
ACT	ACT-512F	ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC
ACT-783R	TACGAGTCCTTCTGGCCCAT
GAPDH	GDF1	GCCGTCAACGACCCCTTCATTGA
GDR1	GGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGT

基因Gene

引物名称Primer name

引物序列（5′-3′）Primer sequence (5′-3′)

ITS

ITS1

TCCGTAGGTGAACCTGCGG

ITS4

TCCTCCGCTTATTGATATGC

TUB2

Bt2a

GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC

Bt2b

ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC

CHS-1

CHS-79F

TGGGGCAAGGATGCTTGGAAGAAG

CHS-354R

TGGAAGAACCATCTGTGAGAGTTG

ACT

ACT-512F

ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC

ACT-783R

TACGAGTCCTTCTGGCCCAT

GAPDH

GDF1

GCCGTCAACGACCCCTTCATTGA

GDR1

GGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGT

组分Component	体积Volume/μL	终浓度Final concentration
10×ThermoPol buffer	2.5	1×
MgSO₄（100 mmol/L）	1.5	6 mmol/L
dNTP Mix（10 mmol/L）	3.5	1.4 mmol/L
Bst DNA polymerase large fragment	1.0	320 U/mL
甜菜碱（20 mmol/L）	1.0	0.8 mmol/L
FIP/BIP primers（10 μmol/L）	4.0	1.6 μmol/L
F3/B3 primers（10 μmol/L）	0.5	0.2 μmol/L
DNA模板	2.0
Nuclease-free water	1.5

组分Component

体积Volume/μL

终浓度Final concentration

10×ThermoPol buffer

2.5

1×

MgSO₄（100 mmol/L）

1.5

6 mmol/L

dNTP Mix（10 mmol/L）

3.5

1.4 mmol/L

Bst DNA polymerase large fragment

1.0

320 U/mL

甜菜碱（20 mmol/L）

1.0

0.8 mmol/L

FIP/BIP primers（10 μmol/L）

4.0

1.6 μmol/L

F3/B3 primers（10 μmol/L）

0.5

0.2 μmol/L

DNA模板

2.0

Nuclease-free water

1.5

引物Primer	引物序列（5′-3′）Primer sequence (5′-3′)	长度Length/bp
Tub-L1	1-F3	CTCGACAGCAATGGAGTGT	19
1-B3	TACTTGTTGCCGGAAGCC	18
1-FIP	GGAGCTCAGAGGTGCCGTTGCTGGCCACATTGGTGGTTG	39
1-BIP	ACCTTATAGCCCCCACAGTGCAGGGTAGGAGCGAAGGTCA	40
Tub-L2	2-F3	GCGCATGATCGTCTACTTCA	20
2-B3	ACCAGACTGGCCGAAGAC	18
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2-BIP	CGTCCTCGTCCATTTGGAGCCAAGAGCTGGCCGAAAGGA	39
2-LoopB	TACCATGGACGCCGTCCGT	19
Tub-CS-L	1-F	CCCACAGTGCAAGATAAACA	20
1-R	GCCGAAGACGAAGTTGTC	18

引物Primer

引物序列（5′-3′）Primer sequence (5′-3′)

长度Length/bp

Tub-L1

1-F3

CTCGACAGCAATGGAGTGT

1-B3

TACTTGTTGCCGGAAGCC

1-FIP

GGAGCTCAGAGGTGCCGTTGCTGGCCACATTGGTGGTTG

1-BIP

ACCTTATAGCCCCCACAGTGCAGGGTAGGAGCGAAGGTCA

Tub-L2

2-F3

GCGCATGATCGTCTACTTCA

2-B3

ACCAGACTGGCCGAAGAC

2-FIP

TGGGTAGGAGCGAAGGTCAGTATACCTTATAGCCCCCACAGT

2-BIP

CGTCCTCGTCCATTTGGAGCCAAGAGCTGGCCGAAAGGA

2-LoopB

TACCATGGACGCCGTCCGT

Tub-CS-L

1-F

CCCACAGTGCAAGATAAACA

1-R

GCCGAAGACGAAGTTGTC

菌株Strain	采集地点Collection location	菌株Strain	采集地点Collection location
DL-1	大路试验示范基地	LY-1	兴隆隆苑咖啡庄园
DL-2	大路试验示范基地	LY-2	兴隆隆苑咖啡庄园
DL-3	大路试验示范基地	LY-3	兴隆隆苑咖啡庄园
TYH-1	兴隆太阳河基地	LY-4	兴隆隆苑咖啡庄园
TYH-2	兴隆太阳河基地	LY-5	兴隆隆苑咖啡庄园
TYH-3	兴隆太阳河基地	LY-6	兴隆隆苑咖啡庄园
TYH-4	兴隆太阳河基地	GY-1	兴隆咖啡公园
ZWY-1	兴隆热带植物园	GY-2	兴隆咖啡公园
ZWY-2	兴隆热带植物园	GY-3	兴隆咖啡公园
ZWY-3	兴隆热带植物园	GY-4	兴隆咖啡公园
ZWY-4	兴隆热带植物园	GY-5	兴隆咖啡公园
ZWY-5	兴隆热带植物园	GY-6	兴隆咖啡公园

菌株Strain

采集地点Collection location

菌株Strain

采集地点Collection location

DL-1

大路试验示范基地

LY-1

兴隆隆苑咖啡庄园

DL-2

大路试验示范基地

LY-2

兴隆隆苑咖啡庄园

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大路试验示范基地

LY-3

兴隆隆苑咖啡庄园

TYH-1

兴隆太阳河基地

LY-4

兴隆隆苑咖啡庄园

TYH-2

兴隆太阳河基地

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兴隆隆苑咖啡庄园

TYH-3

兴隆太阳河基地

LY-6

兴隆隆苑咖啡庄园

TYH-4

兴隆太阳河基地

GY-1

兴隆咖啡公园

ZWY-1

兴隆热带植物园

GY-2

兴隆咖啡公园

ZWY-2

兴隆热带植物园

GY-3

兴隆咖啡公园

ZWY-3

兴隆热带植物园

GY-4

兴隆咖啡公园

ZWY-4

兴隆热带植物园

GY-5

兴隆咖啡公园

ZWY-5

兴隆热带植物园

GY-6

兴隆咖啡公园