热带作物学报

引物名称Primer name	引物序列（5'-3'）Primer sequence (5'-3')	用途function
Actin-F	CGTAGCACCAGAAGAACA	RT-qPCR
Actin-R	CATAAAGGGAGAGGACAG
qCMO-F	TGGAAGGTTTTCTGTGACAACT
qCMO-R	TTAGTGTCCATCCATGGACCAT
MaCMO-F	ATGGCCATCGTAGTGGCAAAG	基因克隆
MaCMO-R	TTAGATGTTACCAAGGCACTCATG
MbCMO-F	ATGGCCATCGTAGTGGCAAAG
MbCMO-R	TTATTCGTGGAGAGCGCCTGC
M13-F	TGTAAAACGACGGCCAGT	菌液PCR
M13-R	CAGGAAACAGCTATGACC

引物名称Primer name	引物序列（5'-3'）Primer sequence (5'-3')	用途function
Actin-F	CGTAGCACCAGAAGAACA	RT-qPCR
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qCMO-F	TGGAAGGTTTTCTGTGACAACT
qCMO-R	TTAGTGTCCATCCATGGACCAT
MaCMO-F	ATGGCCATCGTAGTGGCAAAG	基因克隆
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MbCMO-R	TTATTCGTGGAGAGCGCCTGC
M13-F	TGTAAAACGACGGCCAGT	菌液PCR
M13-R	CAGGAAACAGCTATGACC

蛋白名称Prrotein name	氨基酸数量Amino acids number	分子量Molecular weight/kDa	等电点pI	α-螺旋α-helix/%	延伸链Extended strand/%	β-转角β-turn/%	无规则卷曲Random coil/%	跨膜结构Transmembrane structure	亲疏水性指数Hydrophilicity index	亚细胞定位Subcellular localization
CMO-A	425	47.48	6.36	35.06	15.53	4.71	44.71	无	–0.157	叶绿体
CMO-H	425	47.61	6.23	35.53	16.00	5.41	43.06	无	–0.142	叶绿体
CMO-B1	470	50.35	6.88	35.32	15.11	5.11	44.47	无	–0.208	叶绿体
CMO-B2	450	52.02	5.44	32.67	13.78	4.89	48.67	无	–0.211	叶绿体

蛋白名称Prrotein name	氨基酸数量Amino acids number	分子量Molecular weight/kDa	等电点pI	α-螺旋α-helix/%	延伸链Extended strand/%	β-转角β-turn/%	无规则卷曲Random coil/%	跨膜结构Transmembrane structure	亲疏水性指数Hydrophilicity index	亚细胞定位Subcellular localization
CMO-A	425	47.48	6.36	35.06	15.53	4.71	44.71	无	–0.157	叶绿体
CMO-H	425	47.61	6.23	35.53	16.00	5.41	43.06	无	–0.142	叶绿体
CMO-B1	470	50.35	6.88	35.32	15.11	5.11	44.47	无	–0.208	叶绿体
CMO-B2	450	52.02	5.44	32.67	13.78	4.89	48.67	无	–0.211	叶绿体

香蕉A、B基因组胆碱单加氧酶基因克隆及渗透胁迫下表达特性分析

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朱博为 ¹ , 于佳玄 ¹ , 李新国 ¹^,²^,^* , 刘菊华 ²^,³^,^*

热带作物学报 | 组学与生物技术 2024,45(8): 1538-1551

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热带作物学报 |组学与生物技术 2024 , 45 (8) : 1538 -1551

香蕉A、B基因组胆碱单加氧酶基因克隆及渗透胁迫下表达特性分析

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朱博为¹, 于佳玄¹, 李新国¹^,²^,^*, 刘菊华²^,³^,^*

作者信息

^1.海南大学热带农林学院，海南海口　570228

^2.热带作物生物育种全国重点实验室，海南三亚　572025

^3.中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口　571101

通讯作者:

^* 李新国（LI Xinguo），E-mail：lixinguo13@163.com

刘菊华（LIU Juhua），E-mail：liujuhua@itbb.org.cn。

Cloning and Expression Characteristics of Choline Monooxygenase Gene in Banana A and B Genomes under Osmotic Stress

Bowei ZHU¹, Jiaxuan YU¹, Xinguo LI¹^,²^,^*, Juhua LIU²^,³^,^*

Affiliations

^1.School of Tropical Agriculture and Forestry, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China

^2.National Key Laboratory for Tropical Crop Breeding, Sanya, Hainan 572025, China

^3.Institute of Tropical Crops Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Haikou, Hainan 571101, China

出版时间: 2024-08-25 doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2024.08.003

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摘要

收起

胆碱单加氧酶（CMO）是高等植物体内甜菜碱合成过程中的关键酶，在植物抵御逆境生理过程中具有重要作用。在香蕉A、B参考基因组数据库中分别鉴定到1个CMO基因，对MaCMO与MbCMO基因组序列进行生物学信息分析，发现MbCMO可能由1个香蕉O-岩藻糖基转移酶家族蛋白编码基因与MbCMO基因串联形成。克隆湛江AA（ZJ；AA基因型）、巴西蕉（BX；AAA基因型）、广东大蕉（GD；AAB基因型）和金粉（JF；ABB基因型）的CMO基因编码序列并测序比对，在ZJ和BX中鉴定到基因CMO-A，GD和JF中鉴定到基因CMO-A、CMO-B1和CMO-B2，JF中鉴定到基因CMO-H。鉴定到的4种香蕉CMO基因中，有23个共同的高频密码子，密码子CUU和CCG分别是偏性最强和最弱的密码子。CMO-A蛋白与CMO-H蛋白的氨基酸数量最少，均为425个；CMO-B1蛋白的氨基酸数量最多，为470个，且二级结构最为复杂；CMO-B2蛋白分子量最大，为52.02 kDa；CMO-A分子量最小，为47.48 kDa；4种CMO均属于酸性蛋白，均不具有跨膜结构且均为亲水性蛋白；亚细胞定位预测显示4种CMO均定位在叶绿体中。在进化方面，植物CMO在进化时单、双子叶植物有明显的分支，香蕉CMO-A、CMO-H、CMO-B1、CMO-B2蛋白与其他单子叶植物CMO蛋白亲缘关系更近。RT-qPCR结果显示：4种香蕉根中CMO在渗透胁迫前期上调表达，A基因组纯合型ZJ与BX的CMO表达量高于A、B基因组杂合型GD与JF的CMO表达量；4种香蕉叶中CMO在渗透胁迫前期下调表达，其中A基因组纯合型ZJ与BX的CMO表达量在渗透胁迫后期出现上调表达，A、B基因组杂合型GD与JF的CMO表达量高峰出现在10 d，而后15 d时表达量再次下调，并显著低于ZJ与BX的CMO表达量。本研究揭示了香蕉A、B基因组间CMO基因的差异和不同基因型香蕉中CMO基因在渗透胁迫下的表达模式，为进一步研究香蕉A、B基因组CMO基因生物学功能，特别是来源于不同基因组的CMO基因与香蕉抗渗透胁迫能力间的关系奠定基础，为利用基因工程提高香蕉抗逆性提供参考依据。

关键词

香蕉 / A、B基因组 / 胆碱单加氧酶合成基因 / 表达特性 / 抗逆性

Abstract

收起

Choline monooxygenase (CMO) is a key enzyme in the synthesis of betaine in higher plants and plays an important role in the physiological process of plant resistance to stress. A CMO gene was identified in banana A and B reference genomes in banana gene database, and the biological information analysis of MaCMO and MbCMO genome sequences showed that MbCMO might be formed by a gene encoding a banana O-fucosyltransferase family protein and MbCMO gene in tandem. The CMO gene coding sequences of Zhanjiang AA (ZJ; AA genotype), Baxijiao (BX; AAA genotype), Guangdong Dajiao (GD; AAB genotype) and Jinfen (JF; ABB genotype) were cloned and compared, it was found that ZJ and BX only contained CMO-A, GD and JF both contained CMO-A, CMO-B1 and CMO-B2, and JF also contained CMO-H. Codon usage characteristics showed that there were 23 common high frequency codons among the four banana CMO gene, and the codons CUU and CCG were the most biased and the weakest codons, respectively. The physicochemical properties of CMO-A protein and CMO-H protein showed that the minimum number of amino acids was 425, the maximum number of amino acids was 470, and the secondary structure of CMO-B1 protein was the most complex. The molecular weight of CMO-B2 protein was 52.02 kDa, and the molecular weight of CMO-A protein was 47.48 kDa. All the four CMO proteins were acidic proteins, which did not have a transmembrane structure and were hydrophilic proteins. Subcellular localization prediction showed that all four CMO were localized in chloroplasts. In terms of evolution, plant CMO had obvious branches in monodicotyledonous plants during evolution, and the CMO-A, CMO-H, CMO-B1 and CMO-B2 proteins of banana were more closely related to other monocotyledonous plant CMO proteins. The results of RT-qPCR showed that CMO expression was up-regulated in the four kinds of banana roots in the early stage of osmotic stress, and the expression levels of ZJ and BX CMO in homozygous A genome were higher than those of GD and JF CMO in heterozygous A and B genomes. CMO expression in the four kinds of banana leaves was down-regulated at the early stage of osmotic stress. The expression levels of homozygous ZJ and BX CMO in A genome were up-regulated at the late stage of osmotic stress, while the expression levels of heterozygous GD and JF CMO in A and B genomes peaked at 10 days and then down-regulated again at 15 days later. It was significantly lower than that of ZJ and BX CMO. This study revealed the differences of CMO genes between the A and B genomes of bananas and the expression patterns of CMO genes in different genotypes of bananas under osmotic stress, which would lay a foundation for further research on the biological functions of CMO genes in the A and B genomes of bananas, especially the relationship between CMO genes derived from different genomes and the ability of banana to resist osmotic stress. It would provide a reference for improving the stress resistance of banana by genetic engineering.

Key words

banana / A, B genome / CMO gene / characteristic of expression / stress resistance

引用本文

朱博为, 于佳玄, 李新国, 刘菊华. 香蕉A、B基因组胆碱单加氧酶基因克隆及渗透胁迫下表达特性分析. 热带作物学报, 2024 , 45 (8) : 1538 -1551 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2024.08.003

Bowei ZHU, Jiaxuan YU, Xinguo LI, Juhua LIU. Cloning and Expression Characteristics of Choline Monooxygenase Gene in Banana A and B Genomes under Osmotic Stress[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2024 , 45 (8) : 1538 -1551 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2024.08.003

正文

收起

渗透胁迫作为影响作物生长的主要环境因素之一，是世界农业生产的主要自然灾害，在自然条件下，多种非生物胁迫都会引起植物与环境间渗透势失衡而造成渗透胁迫^[1]。研究表明，当植物受到渗透胁迫时首先表现出组织中相对含水量显著下降，气孔导度降低导致细胞水分缺失，影响植物蒸腾作用^[2]，显著提高叶绿素酶活性，叶绿素生物合成途径受到破坏^[3]，从而抑制植物光合作用^[4]；渗透胁迫会导致植物活性氧失衡，并抑制生物膜活性^[5]。植物始终处于在动态的环境中不断调整新陈代谢和发育的进程之中，为了抵御环境压力，植物进化出了相互关联的调节途径，使它们能够及时地做出反应和适应环境^[6]。渗透调节是指植物通过调节细胞内溶质的含量来保持细胞渗透压的过程，是植物响应渗透胁迫的重要调节机制^[7]。渗透调节物质包括由外界进入细胞的无机离子（K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺等）和植物细胞内合成的有机溶质（甜菜碱、脯氨酸和可溶性糖类等）两大类^[8]。甘氨酸甜菜碱（glycine betaine，GB）是一种广泛存在于高等植物细胞中的季铵碱类化合物^[9]，在植物体内合成路径简单，不易发生代谢，容易被植物吸收，是目前研究最多最有效的渗透调节物质之一^[10]。通过外源喷施GB^[11-12]和基因工程^[13-14]等手段，可以提高非生物胁迫条件下植物内源GB的含量，植物内源GB的积累更有利于植物稳定生物大分子的结构与功能^[15]、增强活性氧清除能力^[16]、减缓渗透胁迫对光系统II（PSII）反应中心酶活的降低^[17]等。总之，植物可以通过积累GB提高其非生物胁迫抗性^[18-19]。

在高等植物中，GB生物合成是由酶促反应来完成，首先以胆碱为底物，在胆碱单加氧酶（choline monooxygenase，CMO）催化下氧化为甜菜碱醛，然后甜菜碱醛在甜菜碱醛脱氢酶（betaine aldehyde dehydrogenase，BADH）催化下最终合成GB，GB合成后不会再被进一步代谢^[20]。BROUQUISSE等^[21]于1989年首次在菠菜（Spinacia oleracea）叶绿体中分离出CMO。CMO是植物中GB合成的限速酶，仅在植物中存在的一种加氧酶^[22]，CMO定位于叶绿体基质中，其分子内部具有Fe-S中心，属于单编码基因^[23]。研究发现，多种植物在胁迫条件下，CMO基因的上调表达可以显著提高植物的抗逆性^[24-26]，刘丹等^[13]将辽宁碱蓬（Suaeda liaotungensis）CMO基因转化烟草（Nicotiana tabacum），盐胁迫下转基因烟草内源GB含量显著提高，烟草耐盐性增强；ZHANG等^[14]将甜菜（Beta vulgaris）CMO基因转化烟草提高了烟草的耐盐抗旱能力；将菠菜CMO基因转化水稻（Oryza sativa）后，发现转基因水稻表现出了对盐胁迫和温度胁迫更强的耐受性^[27]。将细菌codA基因转入番茄（Solanum lycopersicum）中，发现转基因番茄D1蛋白的稳定性显著提高，从而缓解PSII的光抑制^[17]。

香蕉（Musa spp.）属芭蕉科（Musaceae）芭蕉属果树，被世界粮农组织定位为仅次于水稻、小麦（Triticum aestivum）、玉米（Zea mays）的第四大粮食作物^[28]。全世界香蕉栽培品种大约300个，SIMMONDS等^[29]认为香蕉由尖叶蕉（Musa acuminata；A基因组）和长梗蕉（Musa balbisiana；B基因组）2个原始野生蕉种内或种间杂交后代进化而成，还有少数的Musa schizocarpa（S基因组）和Musa textilis（T基因组）^[30]。世界香蕉类型有二倍体（AA、BB）、三倍体（AAA、AAB、ABB和BBB）和四倍体（AAAA、AAAB、AABB和ABBB）等品种。到目前为止，基因组公式的预测仍然是基于染色体数目和形态特征的评价。事实上，不仅不同基因型香蕉的形态差异明显，而且还发现了基因结构与功能水平差异。研究发现，在多种非生物胁迫条件下，不同基因型香蕉表现出抗性差异，低温条件下，ABB与AAA基因型品种幼苗相比具有更强的耐寒性^[31-32]，RAVI等^[33]通过对干旱条件下不同基因型香蕉进行表型分析发现，ABB基因型香蕉比其它基因型香蕉具有更强的抗旱性。WANG等^[34]通过对多种不同基因型香蕉抗旱性分析认为香蕉基因型组成中具B基因组越多的品种，其耐旱性越强的趋势。HU等^[35]通过表型和生理分析证明，ABB基因型的粉蕉比AAA基因型的巴西蕉更耐渗透胁迫、冷胁迫和盐胁迫，并伴随着多种基因在不同基因组类型间差异表达。WU等^[36]通过对香蕉A、B基因组中叶绿素降解途径中SGR1基因表达模式的研究发现，A-SGR1与B-SGR1等位基因在高温条件下的表达存在差异，并对香蕉果皮颜色的调控功能有差异。RAVI等^[37]认为Musa balbisiana可能是在极端天气条件下被驯化的，因此较Musa acuminata具有更好的抗旱能力。随着越来越多的证据表明不同基因组类型的等位基因结构与表达模式以及香蕉品种间的非生物胁迫抗性存在部分差异，而基因结构差异是否导致基因功能差异以及基因功能差异与香蕉渗透胁迫抗性是否存在关联仍有待研究。

目前关于香蕉A、B基因组抗逆相关等位基因的鉴定研究较少，因此，本研究针对香蕉关键渗透调节物质GB合成过程中的限速酶CMO，通过克隆与测序鉴定来源香蕉A、B基因组的CMO基因，运用生物信息学分析手段预测其蛋白结构与功能差异，通过RT-qPCR分析不同基因型香蕉CMO基因在渗透胁迫下的表达模式，以确定其在不同基因型香蕉抗渗透胁迫过程中的作用，为后续进一步揭示香蕉A、B基因组CMO等位基因与不同基因型香蕉抗逆性相关差异的分子机理奠定基础。

1　材料与方法

收起

1.1　材料

以4种不同基因型香蕉[湛江AA（ZJ；AA基因型）、巴西蕉（BX；AAA基因型）、广东大蕉（GD；AAB基因型）和金粉（JF；ABB基因型）]的生长健壮、长势一致，五叶一心的组培苗为材料，组培苗均来源于吸芽增殖，由中国热带农业科学院热作两院种苗组培中心提供。在中国热带农业科学院热带生物技术研究所组培室处理材料，组培室培养条件为：光照12 h（8：00—20：00），光照强度2000 lx，26 ℃，以200 mmol/L甘露醇溶液处理模拟渗透胁迫。于0、5、10、15 d取全叶和全根系，每个时间点随机取样3株苗，取样后迅速放入液氮速冻后转移至–80 ℃超低温冰箱保存。

1.2　方法

1.2.1　香蕉CMO基因鉴定及序列分析

从香蕉基因组数据库（http://banana-genome-hub.southgreen.fr/）中检索AA型野生蕉（Musa acuminata，DH-Pahang）的MaCMO基因（序列号：Macma4_07_g22330）和BB型野生蕉（Musa balbisiana，Pisang Klutuk Wulung）的MbCMO基因（序列号：Mba07_g19660）作为参考序列，并下载MaCMO基因与MbCMO基因的CDS序列、基因全长序列和蛋白序列。利用CD-Search Tool（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）在线网站对MaCMO与MbCMO蛋白保守结构域进行预测，并将基因结构与蛋白保守结构域的分析结果导入TBTOOLS软件进行分析。利用Softberry（http://www.softberry.com）在线预测网站对MbCMO基因进行从头预测，采用IGV-GSAman（v0.6.79）软件可视化分析。

1.2.2　不同基因型香蕉CMO基因克隆及序列分析

根据2个参考序列设计引物（表1）克隆不同基因型香蕉CMO基因的CDS序列。PCR酶使用2×Phanta Max Master Mix P525（Vazyme），PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，35个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物经回收、纯化，与pCE2 TA/Blunt-Zero载体（Vazyme）连接，转化DH5α感受态细胞，菌液PCR筛选阳性克隆，送至北京擎科生物科技有限公司送测。将测序结果导入MAGE（v11.0.13）软件进行序列比对，比对结果导入Jalview（v2.11.27）软件进行可视化分析，在MAGE软件中构建同源树，选用p距离模型用于计算遗传距离。利用生信云在线分析网站（sangon.com）分析不同基因型香蕉CMO基因的CDS序列密码子使用特性，导入TBTOOLS软件绘制热图。

1.2.3　CMO蛋白序列分析及系统进化分析

使用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）在线软件预测分析CMO蛋白编码氨基酸个数、蛋白分子量及等电点等信息。蛋白二级结构预测由Prabi（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/）、Swissmodel（https://swissmodel.expasy.org/）在线软件完成。使用PSORT（https://www.genscript.com/psort.html）在线软件预测亚细胞定位。蛋白亲疏水性分析由ProtScale（https://web.expasy.org/protscale/）在线软件完成。使用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）在线软件作蛋白跨膜结构分析。将蛋白序列导入MEGA软件中进行多重比对，并构建系统发育树。使用Jalview软件进行可视化分析。

1.2.4　RT-qPCR检测

通过多糖多酚RNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取香蕉叶片和全根系RNA，所有样品均用1 μg的RNA通过Prime Script RT reagent Kit（TaKaRa公司，Perfect Real Time）反转录试剂盒反转录成cDNA，反转录产物在–20 ℃下保存备用。以香蕉Actin基因为内参，进行特异性表达分析。反应体系20 μL，反应程序：95 ℃ 7 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，共40个循环。

1.3　数据处理

使用Excel软件进行数据计算；采用2^–∆∆C_T方法分析基因的相对表达量，运用SPSS软件分析数据结果；采用ANOVA过程作方差分析；采用Duncan’s新复极差法作多重比较分析；使用Origin软件绘制表达模式图。

2　结果与分析

收起

2.1　香蕉A、B参考基因组CMO基因结构分析及转录本从头预测

在香蕉A基因组数据库检索获得MaCMO基因，基因序列号Macma4_07_g22330，基因组位于7号染色体（Achr07: 33218743~33223216）；在香蕉B基因组数据库检索获得MbCMO基因，基因序列号Mba07_g19660，基因组位置7号染色体（Bchr07: 30683779~30699810）。MaCMO和MbCMO基因的结构分析结果显示（图1A），MaCMO基因长度为4474 bp，具有10个外显子，9个内含子；MbCMO基因长度为16 032 bp，具有18个外显子，17个内含子。MaCMO和MbCMO蛋白保守结构域分析结果表明（图1B），MaCMO蛋白具有典型的Rieske型[2Fe-2S]结构域和加氧酶家族特征；MbCMO蛋白在具有Rieske型[2Fe-2S]结构域和加氧酶家族特征的同时还具有1个岩藻糖家族结构域特征。通过Softberry在线预测网站对MbCMO基因转录本进行从头预测，发现MbCMO基因同时包含1个香蕉O-岩藻糖基转移酶家族蛋白编码基因与香蕉CMO基因（图1C）。

2.2　不同基因型香蕉中CMO基因的克隆与鉴定

以香蕉A基因组数据库中MaCMO与Softberry在线分析网站分析得到的MbCMO基因为参考序列，设计2对分别克隆香蕉A、B基因组CMO基因特异性引物（表1），以BX、ZJ、JF、GD的cDNA为模板，克隆BX、ZJ、JF、GD中CMO基因编码序列。经序列比对发现（图2），使用MaCMO基因特异性引物在BX、ZJ、GD中各克隆出1种CMO基因系列（分别命名为BXCMO-A、ZJCMO-A、GDCMO-A），在JF中克隆出2种CMO基因序列（分别命名为JFCMO-A、JFCMO-H），5种CMO基因序列与MaCMO序列间相似性为99.31%，共有37个SNPs；使用MbCMO基因特异性引物在GD、JF中各克隆出2种CMO基因转录本序列（分别命名为GDCMO-B1、GDCMO-B2与JFCMO-B1、JFCMO-B2），4种CMO基因序列与MbCMO序列间相似性为98.55%，在GDCMO-B1与JFCMO-B1中鉴定到34个SNPs和3个Indels，分别为24 bp与20 bp的插入突变与4 bp的缺失突变；在GDCMO-B2与JFCMO-B2中鉴定到4个SNP和2个Indels，分别为24 bp与20 bp的插入突变，导致转录于1350 bp提前终止。将在4种不同基因型的香蕉品种中鉴定到的9种CMO基因序列导入MAGE软件中构建同源树发现（图3），9种CMO基因序列与2个CMO参考基因大致分成两簇。其中BXCMO-A、ZJCMO-A、GDCMO-A、JFCMO-A、GDCMO-B1与香蕉A基因组的MaCMO基因归为一簇；JFCMO-H、JFCMO-B1、JFCMO-B2、GDCMO-B2与香蕉B基因组的MbCMO基因归为一簇。因此将与MaCMO基因亲缘关系最近的ZJCMO-A定义为CMO-A；将与MbCMO基因亲源关系较近的JFCMO-B1与GDCMO-B2分别定义为CMO-B1与CMO-B2；由于FJCMO-H可能由A和B基因组重组而形成的，将其定义为CMO-H。

2.3　香蕉CMO基因密码子偏好性分析

相对同义密码子使用频率（relative synonymous codon usage，RSCU）值的大小可以反映密码子的使用频率。一般RSCU值大于1的密码子被认为是高频密码子，RSCU值小于1的则为低频密码子。通过比较发现（图4），在4种香蕉CMO基因中，有23个共同的高频密码子，密码子CUU是4种香蕉CMO基因中偏性最强的密码子，RSCU值均超过2，密码子CCG则是偏性最弱的密码子，在CMO-B1中的RSCU值为0.18，其余3种中。CMO-A中均为0。其中，密码子GGU、CUA、UCG在CMO-A中属于高频密码子，RSCU值分别为1.12、1.02、1.05；密码子GGU、CUA、UCG、UCC、AAA在CMO-H中属于高频密码子，RSCU值分别为1.12、1.02、1.20、1.02、1.00；密码子GGU、UCG、CGC、AAA、CGA、AGC在CMO-B1中属于高频密码子，RSCU值分别为1.20、1.05、1.03、1.00、1.03、1.05；密码子CUA、UCC、AAA、GGG、CUC、AGC在CMO-B2中属于高频密码子，RSCU值分别为1.02、1.09、1.00、1.07、1.02、1.22。

2.4　香蕉CMO蛋白理化性质分析

利用ProtParam工具对蛋白序列进行的蛋白质相关理化性质分析表明（表2），CMO-A蛋白与CMO-H蛋白均由425个氨基酸编码形成，CMO-B1编码氨基酸数量最多，为470个，CMO-B2由450个氨基酸编码形成；CMO-B2蛋白分子量最大，为52.02 kDa，并且等电点最低，为5.44，CMO-A蛋白分子量最小，为47.48 kDa，CMO-B1蛋白等电点最高为6.88，说明4种CMO蛋白均属于酸性蛋白。Prabi分析发现CMO-B1蛋白二级结构较为复杂，CMO-A蛋白二级结构较为简单。TMHMMY预测分析4种CMO蛋白都不具有跨膜结构且亲疏水性指数均小于0，为亲水性蛋白质；亚细胞定位预测显示将4种CMO蛋白均定位在叶绿体中。

2.5　香蕉CMO蛋白系统进化分析及多重序列比对

为进一步研究4种香蕉CMO蛋白的系统进化关系，在NCBI数据库中检索并选取拟南芥（Arabidopsis thaliana）、番茄、玉米、水稻、菠菜、苋菜（Amaranthus tricolor）、大豆（Glycine max）、大麦（Hordeum vulgare）、豇豆（Vigna unguiculata）、甜瓜（Cucumis melo）、橙子（Citrus sinensis）、番石榴（Psidium guajava）、油棕（Elaeis guineensis）、海枣（Phoenix dactylifera）、葡萄（Vitis riparia）、黄瓜（Cucumis sativus）等16个物种CMO蛋白与CMO-A、CMO-H、CMO-B1、CMO-B2蛋白进行系统进化分析。由图5可知，CMO-A、CMO-H、CMO-B1、CMO-B2与EgCMO、PdCMO、ZmCMO、HvCMO、OsCMO 5种单子叶植物共同处于1个分支，表明它们亲缘关系最近。CMO-A、CMO-H、CMO-B1、CMO-B2与SoCMO和AtCMO（拟南芥胆碱单加氧酶蛋白）亲缘关系最远。结果表明，植物CMO在进化时单、双子叶植物有明显的分支，说明物种内的分化时间比物种间的分化时间更晚。蛋白多重序列比对结果显示（图6）。香蕉CMO蛋白序列中都具有典型的Rieske型[2Fe-2S]结构域和铁结合位点，进一步说明香蕉CMO蛋白具有铁离子结合和氧化还原酶活性，并且植物CMO蛋白在进化时C端较N端更为保守。

2.6　渗透胁迫条件下4种基因型香蕉CMO表达模式分析

为探究4种基因型香蕉CMO在渗透胁迫条件下表达特性，通过RT-qPCR对200 mmol/L甘露醇处理后的4种不同基因型香蕉根与叶中CMO表达模式进行分析。以0 d JF处理组CMO表达量作为对照（设相对表达量为1），计算出其他处理组的相对表达量，结果如图7所示，渗透胁迫条件下，在渗透胁迫大部分阶段A基因组纯合型（ZJ与BX）香蕉根叶中的CMO表达量显著高于A、B基因组杂合型（GD与JF）香蕉根叶中的CMO表达量。在根中，A基因组纯合型（ZJ与BX）CMO表达量在0、5、10 d显著高于A、B基因组的杂合型（GD与JF）CMO基因表达量（P<0.05），只有在15 d时ZJCMO表达量与GDCMO表达量无显著差异。ZJ、BX、GD的CMO基因在5 d时表达量出现高峰，分别为CK的7.39、5.69、3.58倍，JF的CMO基因表达量在10 d出现高峰，仅为CK的1.55倍。在叶中，A、B基因组的杂合型（GD与JF）CMO在10 d时表达量出现高峰，其中GD的CMO表达量显著高于ZJ与BX，A基因组的纯合型（ZJ与BX）的CMO表达量在15 d时表达量再次上升且显著高于GD与JF（P<0.05）。

3　讨论

收起

目前，CMO基因已经在多种高等植物中被鉴定，并发现其在植物GB合成以及响应植物胁迫反应时起到重要作用^[38-39]。CMO基因为单拷贝基因^[23]，结合香蕉A、B基因数据库数据，分别发现1个MaCMO与MbCMO基因，MaCMO和MbCMO基因结构分析结果显示：MaCMO基因长度为4432 bp，具有10个外显子；MbCMO基因长度为16 032 bp，具有18个外显子；MbCMO基因长度是MaCMO基因长度的近4倍，多了8个外显子。MaCMO和MbCMO蛋白保守结构域分析结果显示：MaCMO蛋白和MbCMO蛋白具有典型的Rieske型[2Fe-2S]结构域和加氧酶家族特征，而MbCMO蛋白还具有1个岩藻糖家族结构域特征，这与前人报道的大麦^[40]与水稻^[41]等植物CMO蛋白具有的结构域并不完全一致。MbCMO基因转录本进行从头预测发现，MbCMO基因可能由1个香蕉O-岩藻糖基转移酶家族蛋白编码基因与MbCMO基因串联形成，推测可能是由于基因组测序结果在拼接的过程中由于2个基因在基因组中位置较为接近而拼接成1个基因，这种1个基因由多个基因串联形成的现象普遍存在于已有的植物基因组测序结果中^[42-43]。

大量研究表明，相同基因在同一物种不同基因型的品种间可能存在多种转录本。WU等^[36]在AAB\ABB基因型香蕉中同时鉴定到分别来源于A、B基因组的SGR1等位基因；YU等^[44]在4个不同的小麦品种中鉴定来源不同的TaBADH-A与TaBADH-B基因。根据形态学特征，ZJ、BX、GD和JF的基因型分别被预测为AA、AAA、AAB和ABB^[30,45]。本研究选择香蕉关键渗透调节物质GB合成过程中限速酶合成基因CMO作为重点研究基因，探讨不同基因型香蕉CMO基因之间的差异，通过克隆后的测序和序列的多重比对，在4种基因型香蕉中发现了9条CMO基因序列，其中MaCMO基因特异性引物在BX、ZJ、GD中各克隆出1种CMO基因，在JF中克隆出2种CMO基因；MbCMO基因特异性引物在GD、JF中各克隆出2种CMO基因并且在GDCMO-B2与JFCMO-B2中出现Indels使得转录提前终止，蛋白一级结构发生变异。通过构建同源树分析不同来源的CMO基因的亲缘关系，结果表明9条CMO基因与2个CMO参考基因大致分成两簇，包括与香蕉A基因组MaCMO基因亲缘关系较近的归为一簇以及与香蕉B基因组MbCMO基因亲缘关系较近的为另一簇。其中，JFCMO-H具有MaCMO基因和MbCMO基因共同特征，推测其可能由A和B基因组在进化过程中重组而形成的，这种现象符合JERIDI等^[46]的观点。

本研究在CMO-A、CMO-H、CMO-B1、CMOB2中分别有26、28、29、29个最优密码子，其中分别包括18、19、19、18个以A或U结尾的密码子，表明4种香蕉CMO基因对以A或U结尾的密码子偏好性最强，这与前人对香蕉基因组密码子使用偏好性分析的结果并不一致^[47]。蛋白理化性质分析结果显示CMO-A、CMO-H、CMO-B1与CMO-B2均属于酸性蛋白，均不具有跨膜结构且都为亲水性蛋白。与前人对西瓜（Citrullus lanatus）CMO^[48]与沙棘（Hippophae rhamnoides）CMO^[49]蛋白预测结果一致。HANSON等^[9]认为GB的合成是在植物叶绿体基质中完成的，且有研究表明具有Rieske型[2Fe-2S]结构域的CMO蛋白定位在叶绿体基质中^[50]，与本研究亚细胞定位预测的一致。

本研究中，CMO-A、CMO-H、CMO-B1、CMOB2与EgCMO、PdCMO、ZmCMO、HvCMO、OsCMO 5种单子叶植物共同处于1个分支，表明它们亲缘关系最近，剩余的所有双子叶植物处于1个大支，表明CMO在系统进化时，单、双子叶植物之间有明显的分支。这与已经报道过的CMO在同一物种中亲缘关系较近的结果一致^[40-41]，并且前人通过比较香蕉基因组和单、双子叶植物基因组进化过程发现，香蕉基因组与单子叶植物基因组更具有同源性^[51]。CMO是一种仅存在于植物中的加氧酶，并且许多植物并不具有CMO，如拟南芥^[52]、烟草^[53]和水稻^[41]等。有研究者认为部分植物缺乏功能性CMO或无CMO导致其不能自然积累GB^[53]。因此，CMO物种内的分化时间较晚于不同物种之间的分化时间可能与一些植物不具备积累甜菜碱的能力有关。

越来越多的研究表明，不同基因型物种间可能存在不同响应非生物胁迫的模式^[54]，在4个不同的小麦品种在干旱和盐胁迫条件下，BADH- A1b型的表达水平以及甜菜碱积累量显著高于BADHA1a型^[44],CsCMO在抗寒性强的茶树品种中的表达量显著高于抗寒性弱的茶树品种^[38]，本研究4种基因型香蕉CMO基因表达量在渗透胁迫条件下都表现出不同程度的上调趋势，表明香蕉CMO可以响应渗透胁迫，这与前人关于CMO可以响应多种非生物胁迫的结论一致^[24-26]。通过比较4种基因型香蕉渗透胁迫条件下CMO表达量可以发现，A基因型纯合品种（ZJ、BX）的CMO表达量显著高于A基因型与B基因型杂合品种（GD、JF）CMO表达量，推测可能是来源于香蕉A基因组的CMO基因较来源于B基因组的CMO基因具有更强的渗透胁迫响应能力从而导致其在不同基因型香蕉间差异表达。有观点认为，不同基因型香蕉间可能存在不同的信号转导及响应模式，HU等^[35]通过转录组测序分析渗透胁迫、冷胁迫和盐胁迫下ABB基因型的粉蕉与AAA基因型的巴西蕉基因表达情况，发现粉蕉与巴西蕉间存在基因差异表达现象，并认为粉蕉较巴西蕉具有更独立的ABA信号网络；YANG等^[55]研究发现ABB基因型的Dajiao中细胞MPK2磷酸化信号通路较AAA基因型的Cavendish更为保守，导致Dajiao耐寒性强于Cavendish。不同基因型香蕉也可能存在不同的转录激活模式，来源不同基因组的CMO基因的转录对可能受到不同转录因子的诱导，从而引起等位基因特异性表达，最终导致不同基因型香蕉CMO表达量出现差异。前人通过转录组测序分析干旱胁迫条件下，耐旱香蕉品种Saba（ABB基因型）与敏感品种Grand Naine（AAA基因型）基因表达情况，结果表明有46种转录因子家族部分基因出现差异表达，占到差异表达基因总数的15.9%^[56]。等位基因特异性表达是指在含有多于一组同源基因组的物种中存在的一种等位基因之间转录失衡的表达模式^[57]，在植物中，这种基因表达模式可以由不同转录因子的调控而引起^[58-59]。因此，不同基因型香蕉CMO表达量的差异可能与转录调控水平差异导致的等位基因特异性表达密切相关。而本研究中ZJ、BX、GD和JF中来源不同的CMO基因是否存在等位基因特异性表达现象仍有待进一步验证，并且不同的CMO基因表达差异是否导致不同基因型香蕉非渗透胁迫抗性出现差异及其影响香蕉渗透胁迫抗性的机制也有待解析。

本研究在4种不同基因型香蕉中鉴定分别来源于香蕉A、B基因组CMO基因，并对其序列特征和蛋白结构与功能进行了解析，探究了不同基因型香蕉CMO基因在渗透胁迫下的表达模式，以确定其在不同基因型香蕉抗渗透胁迫过程中的作用，为后续进一步揭示香蕉A、B基因组CMO等位基因与不同基因型香蕉抗逆性相关差异的分子机理奠定基础。

基金

收起

海南省自然科学基金项目(320RC485)
国家自然科学基金项目(32160679)
海南省研究生创新科研课题(Qhys2022-99)

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2024年第45卷第8期

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文章信息

doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2024.08.003

接收时间：2023-11-01
首发时间：2026-06-23
出版时间：2024-08-25

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作者

出版历史

收稿日期：2023-11-01
修回日期：2023-12-01

基金

海南省自然科学基金项目(320RC485)

国家自然科学基金项目(32160679)

海南省研究生创新科研课题(Qhys2022-99)

作者信息

^1.海南大学热带农林学院，海南海口　570228

^2.热带作物生物育种全国重点实验室，海南三亚　572025

^3.中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海南海口　571101

通讯作者:

^* 李新国（LI Xinguo），E-mail：lixinguo13@163.com

刘菊华（LIU Juhua），E-mail：liujuhua@itbb.org.cn。

参考文献

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/rdzwxb/CN/10.3969/j.issn.1000-2561.2024.08.003

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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