热带作物学报

引物名称Primer name	引物序列（5ʹ-3ʹ）Primer sequence (5ʹ-3ʹ)
HbPSKR2-F	ATGGATGTCCAAGATTTGTGGGCAATTGTTT
HbPSKR2-R	TTACAACAGGATCACGATTTCGATGTTGTC
pGBDKT7-HbPSKR2-F	CATGGAGGCCGAATTCATGGATGTCCAAGATTTGTGGG
pGBDKT7-HbPSKR2-R	GCAGGTCGACGGATCCTTACAACAGGATCACGATTTCGA
HbPSKR2-nLUC-F	GGACGAGCTCGGTACCATGGATGTCCAAGATTTGTGGGCAA
HbPSKR2-nLUC-R	GCGTACGAGATCTGGTCGACTTACAACAGGATCACGATTTCGATG
HbPBL8-cLUC-F	GTCCCGGGGCGGTACCATGGGCAACTGCGGCACTAGAGAGG
HbPBL8-cLUC-R	CGAAAGCTCTGCAGGTCGACTCATCTAACCCTACAAGCTGCAGGA
HbPIX13-cLUC-F	GTCCCGGGGCGGTACCATGGGCAATTGCTTTGGATCTCCCT
HbPIX13-cLUC-R	CGAAAGCTCTGCAGGTCGACCTAGTTGTCACATGTGAGTCGCCAC

引物名称Primer name	引物序列（5ʹ-3ʹ）Primer sequence (5ʹ-3ʹ)
HbPSKR2-F	ATGGATGTCCAAGATTTGTGGGCAATTGTTT
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pGBDKT7-HbPSKR2-F	CATGGAGGCCGAATTCATGGATGTCCAAGATTTGTGGG
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HbPIX13-cLUC-R	CGAAAGCTCTGCAGGTCGACCTAGTTGTCACATGTGAGTCGCCAC

克隆编号Clone No.	NCBI序列号NCBI accession	基因注释Gene annotation
1	XM_021826051.1	Hevea brasiliensis flowering time control protein FPA
2	XM_021826436.1	Hevea brasiliensis 60S ribosomal protein L15-1-like
3	XM_021812705.1	Hevea brasiliensis uncharacterized
4	XM_021795228.1	Hevea brasiliensis uncharacterized
5	XM_021810009.1	Hevea brasiliensis polyubiquitin-like
6	XM_021836988.1	Hevea brasiliensis E3 ubiquitin-protein ligase CIP8
7	XM_021828633.1	Hevea brasiliensis probable serine/threonine-protein kinase PBL8 AT5G01020
8	XM_021784810.1	Hevea brasiliensis protein LIGHT-DEPENDENT SHORT HYPOCOTYLS 4-like
9	XM_021819060.1	Hevea brasiliensis probable serine/threonine-protein kinase PIX13 AT2G12390
10	XM_021820903.1	Hevea brasiliensis cellulose synthase A catalytic subunit 7
11	XM_021789815.1	Hevea brasiliensis DNA-directed RNA polymerases II, IV and V subunit 11
12	XM_021807104.1	Hevea brasiliensis 60S ribosomal protein L37-3

克隆编号Clone No.	NCBI序列号NCBI accession	基因注释Gene annotation
1	XM_021826051.1	Hevea brasiliensis flowering time control protein FPA
2	XM_021826436.1	Hevea brasiliensis 60S ribosomal protein L15-1-like
3	XM_021812705.1	Hevea brasiliensis uncharacterized
4	XM_021795228.1	Hevea brasiliensis uncharacterized
5	XM_021810009.1	Hevea brasiliensis polyubiquitin-like
6	XM_021836988.1	Hevea brasiliensis E3 ubiquitin-protein ligase CIP8
7	XM_021828633.1	Hevea brasiliensis probable serine/threonine-protein kinase PBL8 AT5G01020
8	XM_021784810.1	Hevea brasiliensis protein LIGHT-DEPENDENT SHORT HYPOCOTYLS 4-like
9	XM_021819060.1	Hevea brasiliensis probable serine/threonine-protein kinase PIX13 AT2G12390
10	XM_021820903.1	Hevea brasiliensis cellulose synthase A catalytic subunit 7
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12	XM_021807104.1	Hevea brasiliensis 60S ribosomal protein L37-3

巴西橡胶树HbPSKR2基因克隆及互作蛋白鉴定

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杜晓愚 ¹^,² , 赵一杰 ³ , 张世鑫 ² , 田维敏 ² , 晁金泉 ²^,^*

热带作物学报 | 组学与生物技术 2024,45(4): 653-662

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热带作物学报 |组学与生物技术 2024 , 45 (4) : 653 -662

巴西橡胶树HbPSKR2基因克隆及互作蛋白鉴定

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杜晓愚¹^,², 赵一杰³, 张世鑫², 田维敏², 晁金泉²^,^*

作者信息

^1.浙江农林大学现代农学院，浙江杭州　311300

^2.中国热带农业科学院橡胶研究所/热带作物生物育种全国重点实验室/农业农村部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室/省部共建国家重点实验室培育基地-海南省热带作物栽培生理学重点实验室，海南海口　571101

^3.海南大学热带作物学院，海南海口　570228

通讯作者:

^* 晁金泉（CHAO Jinquan），E-mail：tianwang208@163.com。

Cloning and Interacted Protein Identification of HbPSKR2 Gene from Rubber Tree

Xiaoyu DU¹^,², Yijie ZHAO³, Shixin ZHANG², Weimin TIAN², Jinquan CHAO²^,^*

Affiliations

^1.College of Advance Agricultural Sciences, Zhejiang A&F University, Hangzhou，Zhejiang 311300, China

^2.Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / National Key Laboratory for Tropical Crop Breeding / Key Laboratory of Rubber Biology, Ministry of Agriculture & Rural Affairs / State Key Laboratory Incubation Base for Cultivation & Physiology of Tropical Crops, Haikou, Hainan 571101, China

^3.College of Tropical Crops, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China

出版时间: 2024-04-25 doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2024.04.001

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摘要

收起

磺肽素是一种高等植物特有的小肽类激素，广泛参与植物的生长发育、分裂分化、生物或非生物胁迫等生物学过程。磺肽素受体蛋白（phytosulfokine receptor，PSKR）是磺肽素的直接受体，对于磺肽素信号传导至关重要。本研究采用RT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction）技术克隆了橡胶树的HbPSKR2基因，并对其进行生物信息学、基因表达模式、互作蛋白筛选及鉴定分析。结果显示HbPSKR2基因的开放阅读框全长3159 bp，编码1052个氨基酸，理论分子量为114.84 kDa，理论等电点为6.34。结构域分析显示HbPSKR2属于典型的跨膜蛋白，前640个氨基酸是由亮氨酸重复组成的天线结构，第692~714个氨基酸是跨膜结构域，第765~1052个氨基酸是膜内激酶结构域。对HbPSKR2膜内激酶结构域以及拟南芥和水稻的PSKR同源序列进行多重比对，结果显示均存在ATP binding site、CaM binding site、Activation segment、GC Centre等保守性位点。表达模式分析显示，HbPSKR2基因在橡胶树形成层区高丰度表达，其表达量在冠菌素处理前期显著上升。通过酵母双杂交技术筛选到12个与HbPSKR2互作的候选蛋白，并对其中的2个蛋白激酶（HbPBL8和HbPIX13）与HbPSKR2的互作关系进行荧光素酶互补成像验证。结果显示，在烟草中共转化HbPSKR2-nLUC/HbPBL8-cLUC和HbPSKR2-nLUC/HbPIX13-cLUC可以观察到强烈的荧光信号，进一步证明了HbPSKR2在体内可与HbPBL8激酶和HbPIX13激酶互作。橡胶树HbPSKR2基因克隆及互作蛋白鉴定将为深入揭示橡胶树乳管分化分子机制提供新的思路。

关键词

巴西橡胶树 / HbPSKR2 / 酵母双杂交 / 荧光素酶互补成像 / 互作蛋白

Abstract

收起

Phytosulfokine (PSK) is a small peptide hormone unique to higher plants, widely involved in biological processes such as plant growth and development, division and differentiation, biotic and abiotic stress. PSK receptor (PSKR) is a direct receptor for PSK and is crucial for PSK signal transduction. In the present study, HbPSKR2 was cloned from rubber tree by RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction), and its bioinformatics, gene expression pattern, interacted proteins screening and identification were also analyzed. Results showed that the open reading frame of reading frame of HbPSKR2 had a total length of 3159 bp and encoded 1052 amino acids with molecular weight 114.84 kDa and theoretical isoelectric point 6.34. Domain analysis showed that HbPSKR2 was a typical trans-membrane protein. The first 640 amino acids were the antenna structures composed of leucine rich repeat (LRR), the 692 to 714 amino acids were transmembrane domains, and the 765 to 1052 amino acids were kinase domains. Multiple comparisons were conducted on the membrane kinase domain of HbPSKR2 and the membrane kinase domain of PSKR homologous proteins in Arabidopsis and rice. The results showed the existence of conserved sites such as ATP binding site, CaM binding site, Activation segment, GC Centre. Expression pattern analysis showed that HbPSKR2 was highly expressed in the cambium region of rubber tree. The expression level of HbPSKR2 was significantly increased at the early stage of coronatine (COR) treatment. Twelve candidate proteins interacted with HbPSKR2 were screened by yeast two hybrid technology, and the interaction between two protein kinases (HbPBL8 and HbPIX13) and HbPSKR2 was further verified by luciferase complementary imaging. The strong fluorescence signal was observed by co-transformation HbPSKR2-nLUC/HbPBL8-cLUC and HbPSKR2-nLUC/HbPIX13-cLUC into tobacco, suggesting the interaction between HbPSKR2-HbPBL8 and HbPSKR2- HbPIX13 in vivo. The cloning of HbPSKR2 and identification of HbPSKR2 interacted protein would provide new insights into the molecular mechanism of laticifer differentiation in rubber tree.

Key words

Hevea brasiliensis / HbPSKR2 / yeast two-hybrid / luciferase complementary imaging / interaction protein

引用本文

杜晓愚, 赵一杰, 张世鑫, 田维敏, 晁金泉. 巴西橡胶树HbPSKR2基因克隆及互作蛋白鉴定. 热带作物学报, 2024 , 45 (4) : 653 -662 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2024.04.001

Xiaoyu DU, Yijie ZHAO, Shixin ZHANG, Weimin TIAN, Jinquan CHAO. Cloning and Interacted Protein Identification of HbPSKR2 Gene from Rubber Tree[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2024 , 45 (4) : 653 -662 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2024.04.001

正文

收起

磺肽素（phytosulfokine，PSK）是一种高等植物特有的小肽类激素，广泛参与植物的生长发育、分裂分化、逆境胁迫等生物学过程^[1-3]。磺肽素基因编码的前体多肽长度约为80~110个氨基酸，通过翻译后剪切形成5个氨基酸的小肽（Tyr-Ile-Tyr-Thr-Gln），而后在酪氨酸硫化转移酶的作用下对其第1位和第3位的酪氨酸（tyrosine，Tyr）发生特异的磺基化修饰，最终形成有活性形式的磺肽素^[4-5]。与其他植物激素一样，磺肽素信号传导也依赖于细胞膜定位的受体蛋白。磺肽素受体（phytosulfokine receptor，PSKR）是一种典型的跨膜蛋白，其膜外的亮氨酸重复元件（leucine rich repeat，LRR）主要用于感知磺肽素信号，而膜内的激酶结构域主要用于下游信号的传导^[6-7]。PSKR在植物中一般有2个成员，目前对其功能的研究还比较少。ZHANG等^[8]发现番茄的SlPSKR1和SlPSKR2均可与PSK结合，并且证明PSKR1通过促进钙调素与生长素合成蛋白YUC的互作进而激活番茄对疫霉病的响应。HOLZWART等^[9]报道拟南芥的PSKR1可以和RLP44蛋白互作，在调控形成层向木质部分化过程中起关键作用。

天然橡胶是一种重要的工业原料，在医疗卫生、交通运输、航空航天等领域具有广泛应用^[10-11]。巴西橡胶树（Hevea brasiliensis Muell. Arg）原产南美洲亚马逊雨林地区，是当前世界天然橡胶的主要来源^[12]。位于橡胶树树皮内层的次生乳管是天然橡胶合成和贮存的主要场所。橡胶树胶乳本质上是乳管细胞的细胞质部分，含30%~50%的天然橡胶^[13]。生产上人们通过割胶的方式收集从被切断乳管中流出的胶乳用于天然橡胶加工，因此橡胶树的次生乳管是决定天然橡胶产量的结构基础。前人研究表明，橡胶树次生乳管由形成层分化而来，茉莉酸信号途径在该过程中起关键作用^[14-15]。最近课题组研究发现磺肽素参与了茉莉酸诱导次生乳管分化^[16]。本研究克隆了橡胶树磺肽素受体HbPSKR2，并对其互作蛋白进行筛选和鉴定，为深入揭示橡胶树乳管分化分子机制提供新的思路。

1　材料与方法

收起

1.1　材料

橡胶树形成层区cDNA、橡胶树形成层区酵母双杂交文库、酵母双杂交诱饵载体pGBKT7、pCAMBIA1300-nLUC、pCAMBIA1300-cLUC均由本实验室保存；本生烟播种于中国热带农业科学院橡胶研究所植物培养室，培养至4~7叶期备用；农杆菌菌株GV3101、酵母菌株Y187、酵母菌株AH109、大肠杆菌DH5α感受态细胞均购自上海唯地生物技术有限公司；橡胶树全基因组序列从NCBI下载（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/LVXX00000000.1）；组织特异性及割胶前后胶乳的转录组原始数据从国家基因组数据中心下载（https://ngdc.cncb.ac.cn），GSA编号为CRA004268；冠菌素（COR）处理形成层的转录组原始数据从NCBI下载（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/s），数据编号分别为SRR3423347~SRR3423350。

1.2　方法

1.2.1　 HbPSKR2基因的克隆

以拟南芥AtPSKR2蛋白序列对橡胶树基因组进行BLASTn搜索，得到含橡胶树完整HbPSKR2序列的scaffold0093_ 1558507。根据序列信息设计扩增HbPSKR2完整开放阅读框的特异性引物HbPSKR2-F和HbPSKR2-R（表1），以橡胶树形成层区cDNA为模板进行PCR扩增。扩增体系为：2×PCR buffer 10 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各1 μL，cDNA模板1 μL，ddH₂O 7 μL；扩增程序为：98 ℃预变性5 min；98 ℃变性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，共设置33个循环；最终72 ℃延伸10 min。扩增产物用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根生化科技有限公司）进行回收纯化，通过pEASYBlunt Cloning Kit（全式金生物科技有限公司）连接载体并转化大肠杆菌DH5α。过夜培养后挑选阳性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.2.2　HbPSKR2的生物信息学分析

利用在线工具Compute pI/Mw（http://web.expasy.org/compute_pi/）分析HbPSKR2的分子量和等电点；利用在线结构域分析工具SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）分析HbPSKR2的结构域；利用DNAMAN软件分析HbPSKR2与其他植物同源蛋白间的序列比对；利用在线工具iTQL（https://itol.embl.de/）绘制HbPSKR2与其他植物同源蛋白间的系统发育树；利用依托单位服务器，采用Tophat软件将所下载的转录组原始数据比对到橡胶树基因组上，根据Cufflink软件计算基因的FPKM值。

1.2.3　HbPSKR2的自激活检测

以测序正确的pEASY-HbPSKR2质粒为模板，用特异性引物pGBDKT7-HbPSKR2-F和pGBDKT7-HbPSKR2-R扩增目的片段，采用ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）同源重组方法构建pGBDKT7-HbPSKR2的Bait载体。将测序正确的质粒转化至酵母Y187菌株，涂布于SD/-Trp/-Leu、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade固体培养基上，30 ℃倒置培养3 d观察菌落生长情况。

1.2.4　HbPSKR2的酵母双杂交文库筛选

将pGBDKT7-HbPSKR2和橡胶树形成层酵母cDNA文库分别转化至Y187和AH109酵母感受态细胞中，分别涂布于SD/-Trp和SD/-Leu筛选平板，30 ℃恒温培养3~4 d。用涂布棒刮取上述Prey菌株和Bait菌株，分别接种于相应筛选培养基中，30 ℃振荡培养至OD₆₀₀=0.8。离心收集菌体，用YPDA液体培养基重悬菌体并调整至细胞密度大于1×10⁸ mL^–1。将二者等体积混匀，接种于YPDA液体培养基中扩大培养。在相差显微镜下观察酵母菌液产生合子后收集菌体，涂布SD/-Leu/-Trp筛选平板置于30 ℃倒置培养。挑取候选阳性菌落分别点板SD/-Leu/-Trp二缺和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade四缺筛选平板，30 ℃倒置观察菌落生长情况。挑选四缺平板阳性菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.2.5　荧光素酶互补验证

用特异性引物HbPSKR2-nLUC-F和HbPSKR2-nLUC-R扩增测序正确的pEASY-HbPSKR2质粒并连接pCAMBIA1300-nLUC载体；用特异性引物HbPBL8- cLUC-F/HbPBL8-cLUC-R和HbPIX13-cLUC-F/HbPIX13-cLUC-R分别扩增测序正确的阳性酵母菌株并连接pCAMBIA1300-cLUC载体。将连接好的载体转化大肠杆菌DH5α过夜培养并送样测序，将测序正确的pCAMBIA1300-HbPSKR2-nLUC、pCAMBIA1300-HbPBL8-cLUC、pCAMBIA1300-HbPIX13-cLUC质粒分别转化农杆菌GV 3101感受态，并于YEB液体培养基中28 ℃过夜培养。离心收集菌体，用培养液调整OD₆₀₀=1.0，通过注射法注射烟草叶片。注射后的烟草暗培养24 h后在相同注射部位注射荧光素酶底物D-荧光素钾盐溶液，置于活体成像系统中观察。

2　结果与分析

收起

2.1　 HbPSKR2基因克隆及其编码蛋白分析

以HbPSKR2开放阅读框引物对橡胶树形成层区cDNA扩增，获得一条与预期大小一致的条带。测序结果显示，扩增产物长度为3159 bp，编码1052个氨基酸（图1A）。HbPSKR2的理论分子量为114.84 kDa，理论等电点为6.34。蛋白结构域分析显示HbPSKR2是个典型的跨膜蛋白，其中前640个氨基酸是由22个LRR结构域组成的膜外天线，第692个氨基酸至第714个氨基酸是跨膜结构域，第765个氨基酸至第1052个氨基酸是介导膜内信号途径的激酶结构域（图1B）。

2.2　HbPSKR2系统进化及多序列比对分析

选取拟南芥（Arabidopsis thaliana，At2g02220，At5g53890）、樱桃（Prunus persica，XP_007227028.1）、榴莲（Durio zibethinus，XP_022776608.1）、蓖麻（Ricinus communis，XP_002518809.2，EEF34126.1）、柚子（Citrus clementina，XP_024035321.1，XP_ 006451809.1）、树棉（Gossypium arboretum，XP_ 017632150.1）、油菜（Brassica napus，XP_ 013707217.1，XP_022546871.2）、毛果杨（Populus trichocarpa，XP_002312507.3，XP_002317487.3）8种双子叶植物和水稻（Oryza sativa，LOC_Os02g 41890.1，LOC_Os04g57630.1）、玉米（Zea mays，AQK72791.1，NP_001340572.1）、高粱（Sorghum bicolor，XP_002454207.1，XP_021318925.1）、小麦（Triticum aestivum，XP_044413269.1，XP_ 044335016.1）4种单子叶植物的PSKR序列，与HbPSKR2共同构建系统发育树。结果显示所有PSKR成员可以划分为4个类群：Group I类群由双子叶植物PSKR1构成；Group II类群由双子叶植物PSKR2构成；Group III类群由单子叶植物PSKR1构成；Group IV类群由单子叶植物PSKR2构成（图2A）。其中HbPSKR2属于Group II类群，且与来自蓖麻的RcPSKR2亲缘关系最接近。

作为跨膜受体蛋白，PSKR的膜内激酶结构域是介导信号传导的关键部分。采用DNAMAN软件对HbPSKR2的膜内激酶结构域以及拟南芥和水稻的PSKR同源蛋白的膜内激酶结构域进行多重比对，结果显示均存在ATP binding site、CaM binding site、Activation segment、GC Centre等保守性位点（图2B）。

2.3　 HbPSKR2基因表达模式分析

组织特异性分析显示，HbPSKR2在橡胶树各个组织中均有表达，其中在形成层、雌花、雄花中表达丰度较高，而在胶乳、叶片、树皮中表达丰度较低（图3A）。冠菌素（coronatine，COR）是一种茉莉酸类似物，可以有效诱导橡胶树形成层分化次生乳管。HbPSKR2的表达量在冠菌素处理前期（COR-A）较对照（CK-A）有显著上升，而在处理后期（COR-B）与对照（CK-B）相比则差异不显著（图3B）。割胶是收获天然橡胶的唯一方式。与未开割树相比，HbPSKR2在开割树胶乳中的表达量极显著上升（图3C）。

2.4　HbPSKR2诱饵载体自激活检测及互作蛋白筛选

采用重组法构建pGBKT7-HbPSKR2诱饵载体。自激活实验结果显示，含pGBKT7-53阳性对照载体的酵母菌在SD-TL二缺培养基和SDTLHA四缺培养基上均可以生长，并且加入x-gal后菌落变蓝。而含pGBKT7-Lam阴性对照载体的酵母菌以及含pGBKT7-HbPSKR2载体的酵母菌只能在SD-TL二缺培养基上生长（图4A），表明HbPSKR2无细胞毒性及自激活活性，可以用于酵母文库筛选。

将含橡胶树形成层区酵母cDNA文库质粒的酵母AH109菌株和含pBGKT7-HbPSKR2的酵母Y187菌株共培养，镜检发现合子后收集菌体涂布至SD-TL二缺平板进行培养，挑选阳性菌落接种于SD-TLHA四缺平板进行进一步筛选。最终得到12个阳性克隆（图4B）。对阳性克隆插入片段进行测序，测序结果在橡胶树数据库进行BLASTx同源比对，鉴定到2个核糖体相关成员、2个泛素化相关成员、2个生长发育相关成员、2个蛋白激酶、1个RNA聚合酶、1个几丁质酶以及2个功能未知蛋白（表2）。

2.5　HbPSKR2与蛋白激酶HbPBL8和HbPIX13的互作验证

蛋白激酶在信号传导中起重要作用。在HbPSKR2互作蛋白中鉴定到2个蛋白激酶HbPBL8和HbPIX13，推测其可能介导橡胶树PSK的信号传导。分别构建HbPSKR2-nLUC载体、HbPBL8-cLUC以及HbPIX13-cLUC载体，采用LCI技术在烟草叶片中验证HbPSKR2与HbPBL8和HbPIX13的互作关系。结果显示共转HbPSKR2-nLUC/HbPBL8-cLUC和HbPSKR2-nLUC/HbPIX13-cLUC可以检测到强烈的荧光信号（图5A），进一步证明HbPSKR2在体内可以与HbPBL8激酶和HbPIX13激酶互作。

2.6　 HbPBL8和HbPIX13响应COR处理的表达模式分析

通过分析COR处理的橡胶树形成层区转录组数据，HbPBL8表达量在COR处理前期和后期均较对照显著上调，而HbPIX13表达量则在COR处理前后均无差异（图5B）。

3　讨论

收起

PSKR是PSK的直接受体，在PSK信号传导中起重要作用^[6-7]。本研究克隆了橡胶树的HbPSKR2基因。序列分析显示，HbPSKR2是一个跨膜蛋白，含有PSKR蛋白典型的膜外LRR结构域和膜内激酶结构域。组织特异性分析显示HbPSKR2在橡胶树形成层区域相对表达丰度最高，并且在COR处理早期被显著诱导。课题组前期研究发现茉莉酸信号在诱导形成层分化次生乳管过程中起重要作用^[14-15]，近期已有研究证明PSK参与了茉莉酸诱导乳管分化过程^[16]。鉴于HbPSKR2在形成层区域高丰度表达，且可被茉莉酸类似物诱导，因此推测该基因可能参与了橡胶树的乳管分化。

酵母双杂交文库筛选是鉴定互作蛋白的常用方法^[17]。本研究构建了HbPSKR2诱饵表达载体，对橡胶树形成层区域酵母双杂交文库进行筛选，共得到12个候选蛋白，测序分析显示这些成员涉及初生代谢、生长发育、信号传导等多个生物学途径。蛋白质是生命活动的主要承担者，其生物合成和降解过程直接关系着生命活动的进行^[18]。核糖体是真核生物中与蛋白质合成密切相关的细胞器，由不同大小的亚基组成^[19]。泛素化是真核生物普遍存在的翻译后修饰方式，通过将靶标蛋白标记泛素标签进而启动蛋白质的降解^[20-21]。本研究从HbPSKR2互作蛋白中发现2个核糖体相关成员和2个泛素化相关成员，表明PSK信号途径可能直接参与橡胶树蛋白质合成和降解过程。

蛋白激酶是一种催化蛋白质发生磷酸化修饰的酶^[22]。生物体内的蛋白磷酸化是调控蛋白活力和功能的重要机制之一，在细胞信号传导过程中起重要作用^[23-25]。作为一种受体蛋白，已有报道PSKR可以和多种激酶互作，参与不同的生物学过程。如WANG等^[26]报道拟南芥中PSK与PSKR互作后可以改变结合位点附近的空间构象，促使PSKR与体细胞胚胎发育受体激酶（somatic embryogenesis receptor kinase，SERK）发生互作；HOLZWART等^[9]报道拟南芥的受体蛋白RLP44可以介导油菜素内酯关键成员BRI1-ASSOCIATED KINASE 1（BAK1）与PSKR1互作，以复合体的形式介导形成层分化木质部。本研究中通过荧光素酶实验证明2个蛋白激酶HbPIX13和HbPBL8与HbPSKR2之间存在强烈互作，基因表达模式分析显示HbPBL8可被COR显著诱导，推测HbPSKR2-HbPBL8信号通路可能在橡胶树乳管分化过程中起一定作用。揭示HbPBL8的靶标蛋白将是下一步的工作重点。

基金

收起

热带作物生物育种全国重点实验室科研项目(NKLTCB202309)
现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-33-YZ1)
海南省自然科学基金高层次人才项目(322RC781)

参考文献

收起

文献

收起

参考文献引证文献

排序方式：

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MATSUBAYASHI

, SAKAGAMI

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KAUFMANN

, SAUTER

. Sulfated plant peptide hormones[J]. Journal of Experimental Botany, 2019, 70(16): 4267-4277.

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2024年第45卷第4期

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文章信息

doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2024.04.001

接收时间：2023-06-27
首发时间：2026-06-23
出版时间：2024-04-25

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作者

出版历史

收稿日期：2023-06-27
修回日期：2023-09-04

基金

热带作物生物育种全国重点实验室科研项目(NKLTCB202309)

现代农业产业技术体系建设专项资金(CARS-33-YZ1)

海南省自然科学基金高层次人才项目(322RC781)

作者信息

^1.浙江农林大学现代农学院，浙江杭州　311300

^3.海南大学热带作物学院，海南海口　570228

通讯作者:

^* 晁金泉（CHAO Jinquan），E-mail：tianwang208@163.com。

参考文献

分享链接

https://castjournals.cast.org.cn/joweb/rdzwxb/CN/10.3969/j.issn.1000-2561.2024.04.001

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

引物名称Primer name	引物序列（5ʹ-3ʹ）Primer sequence (5ʹ-3ʹ)
HbPSKR2-F	ATGGATGTCCAAGATTTGTGGGCAATTGTTT
HbPSKR2-R	TTACAACAGGATCACGATTTCGATGTTGTC
pGBDKT7-HbPSKR2-F	CATGGAGGCCGAATTCATGGATGTCCAAGATTTGTGGG
pGBDKT7-HbPSKR2-R	GCAGGTCGACGGATCCTTACAACAGGATCACGATTTCGA
HbPSKR2-nLUC-F	GGACGAGCTCGGTACCATGGATGTCCAAGATTTGTGGGCAA
HbPSKR2-nLUC-R	GCGTACGAGATCTGGTCGACTTACAACAGGATCACGATTTCGATG
HbPBL8-cLUC-F	GTCCCGGGGCGGTACCATGGGCAACTGCGGCACTAGAGAGG
HbPBL8-cLUC-R	CGAAAGCTCTGCAGGTCGACTCATCTAACCCTACAAGCTGCAGGA
HbPIX13-cLUC-F	GTCCCGGGGCGGTACCATGGGCAATTGCTTTGGATCTCCCT
HbPIX13-cLUC-R	CGAAAGCTCTGCAGGTCGACCTAGTTGTCACATGTGAGTCGCCAC

引物名称Primer name

引物序列（5ʹ-3ʹ）Primer sequence (5ʹ-3ʹ)

HbPSKR2-F

ATGGATGTCCAAGATTTGTGGGCAATTGTTT

HbPSKR2-R

TTACAACAGGATCACGATTTCGATGTTGTC

pGBDKT7-HbPSKR2-F

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pGBDKT7-HbPSKR2-R

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HbPSKR2-nLUC-F

GGACGAGCTCGGTACCATGGATGTCCAAGATTTGTGGGCAA

HbPSKR2-nLUC-R

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HbPBL8-cLUC-R

CGAAAGCTCTGCAGGTCGACTCATCTAACCCTACAAGCTGCAGGA

HbPIX13-cLUC-F

GTCCCGGGGCGGTACCATGGGCAATTGCTTTGGATCTCCCT

HbPIX13-cLUC-R

CGAAAGCTCTGCAGGTCGACCTAGTTGTCACATGTGAGTCGCCAC

克隆编号Clone No.	NCBI序列号NCBI accession	基因注释Gene annotation
1	XM_021826051.1	Hevea brasiliensis flowering time control protein FPA
2	XM_021826436.1	Hevea brasiliensis 60S ribosomal protein L15-1-like
3	XM_021812705.1	Hevea brasiliensis uncharacterized
4	XM_021795228.1	Hevea brasiliensis uncharacterized
5	XM_021810009.1	Hevea brasiliensis polyubiquitin-like
6	XM_021836988.1	Hevea brasiliensis E3 ubiquitin-protein ligase CIP8
7	XM_021828633.1	Hevea brasiliensis probable serine/threonine-protein kinase PBL8 AT5G01020
8	XM_021784810.1	Hevea brasiliensis protein LIGHT-DEPENDENT SHORT HYPOCOTYLS 4-like
9	XM_021819060.1	Hevea brasiliensis probable serine/threonine-protein kinase PIX13 AT2G12390
10	XM_021820903.1	Hevea brasiliensis cellulose synthase A catalytic subunit 7
11	XM_021789815.1	Hevea brasiliensis DNA-directed RNA polymerases II, IV and V subunit 11
12	XM_021807104.1	Hevea brasiliensis 60S ribosomal protein L37-3

克隆编号Clone No.

NCBI序列号NCBI accession

基因注释Gene annotation

XM_021826051.1

Hevea brasiliensis flowering time control protein FPA

XM_021826436.1

Hevea brasiliensis 60S ribosomal protein L15-1-like

XM_021812705.1

Hevea brasiliensis uncharacterized

XM_021795228.1

Hevea brasiliensis uncharacterized

XM_021810009.1

Hevea brasiliensis polyubiquitin-like

XM_021836988.1

Hevea brasiliensis E3 ubiquitin-protein ligase CIP8

XM_021828633.1

Hevea brasiliensis probable serine/threonine-protein kinase PBL8 AT5G01020

XM_021784810.1

Hevea brasiliensis protein LIGHT-DEPENDENT SHORT HYPOCOTYLS 4-like

XM_021819060.1

Hevea brasiliensis probable serine/threonine-protein kinase PIX13 AT2G12390

XM_021820903.1

Hevea brasiliensis cellulose synthase A catalytic subunit 7

XM_021789815.1

Hevea brasiliensis DNA-directed RNA polymerases II, IV and V subunit 11

XM_021807104.1

Hevea brasiliensis 60S ribosomal protein L37-3