热带作物学报

引物名称 Primer name	引物序列（5′–3′） Primer sequence（5′–3′）
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引物名称 Primer name	引物序列（5′–3′） Primer sequence（5′–3′）
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芥蓝几丁质酶基因家族对环境信号的响应分析

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曾语 ¹ , 吴卉芳 ¹ , 邱昱岑 ¹ , 于雪晴 ¹ , 朱俊杰 ¹ , 谢炳峰 ¹ , 吕美玲 ¹^,²^,^*

热带作物学报 | 组学与生物技术 2025,46(10): 2355-2363

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热带作物学报 | 组学与生物技术 2025, 46(10): 2355-2363

芥蓝几丁质酶基因家族对环境信号的响应分析

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曾语¹, 吴卉芳¹, 邱昱岑¹, 于雪晴¹, 朱俊杰¹, 谢炳峰¹, 吕美玲¹^,²^,^*

作者信息

1.福建农林大学园艺学院，福建福州　350002

2.福建省植物功能生物学与绿色农业重点实验室，福建福州　350002

曾语（2002—），女，硕士研究生，研究方向：芥蓝分子育种。

通讯作者:

*吕美玲，E-mail：mllyu@fafu.edu.cn。

Analysis of Response of Chitinase Gene Family to Environmental Signals in Chinese Kale

Yu ZENG¹, Huifang WU¹, Yucen QIU¹, Xueqing YU¹, Junjie ZHU¹, Bingfeng XIE¹, Meiling LYU¹^,²^,^*

Affiliations

1. College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China

2. Fujian Provincial Key Laboratory of Plant Functional Biology, Fuzhou, Fujian 350002, China

出版时间: 2025-10-25 doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.10.007

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摘要

收起

几丁质酶与植物的逆境抗性和生长发育密切相关。为了揭示植物激素及环境胁迫对芥蓝几丁质酶基因表达的影响，本研究使用水杨酸（SA）、1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）、茉莉酸甲酯（MeJA）等3种植物激素，以及胡萝卜软腐果胶杆菌（Pectobacterium carotovorum subsp. Brasiliense）、高温等2种胁迫分别对白花芥蓝（Brassica oleracea cv. BaiHua）植株进行处理，并采用qRT-PCR方法分析芥蓝几丁质酶基因家族成员的转录水平。结果表明：在芥蓝的几丁质酶基因家族中，18个基因能响应植物激素的诱导表达，16个基因能够被软腐菌显著诱导表达，8个基因对高温胁迫有响应。该研究表明芥蓝相关几丁质酶基因能够响应激素信号和环境胁迫，可能在抗逆境和生长发育中发挥相应功能，该结果可为芥蓝等作物分子育种研究提供参考依据。

关键词

芥蓝 / 几丁质酶基因 / 植物激素 / 抗逆机理 / qRT-PCR

Abstract

收起

Chitinase plays a crucial role in plant stress resistance and growth development. To elucidate the effects of plant hormones and environmental stress on the expression of the mustard chitinase gene, this study investigated three plant hormones-salicylic acid (SA), 1-amino-cyclopropane-1-carboxylic acid (ACC), and methyl jasmonate (MeJA)—and the influence on the transcriptional regulation of the chitinase gene family in Brassica oleracea cv. BaiHua. Additionally, seedlings were subjected to two stress conditions: infection by Pectobacterium carotovorum subsp. Brasiliense and exposure to high temperature. The transcriptional levels of the Chinese kale chitinase gene family members were analyzed using the quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) method. Results demonstrated that among the 18 genes within the chitinase gene family of Chinese mustard, 16 exhibited significant induction under soft rot fungal infection, while 8 responded to high-temperature stress. Furthermore, all 18 genes showed responsiveness to plant hormone-induced expression. This study highlights the potential role of the chitinase gene in mediating responses to hormonal signals and environmental stress, thereby contributing to stress resistance and growth development in plants. The findings would provide valuable insights for future molecular breeding strategies targeting Chinese kale.

Key words

Chinese kale / chitinase genes / plant hormones / mechanism of stress resistance / qRT-PCR

引用本文

曾语, 吴卉芳, 邱昱岑, 于雪晴, 朱俊杰, 谢炳峰, 吕美玲. 芥蓝几丁质酶基因家族对环境信号的响应分析. 热带作物学报, 2025 , 46 (10) : 2355 -2363 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.10.007

Yu ZENG, Huifang WU, Yucen QIU, Xueqing YU, Junjie ZHU, Bingfeng XIE, Meiling LYU. Analysis of Response of Chitinase Gene Family to Environmental Signals in Chinese Kale[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2025 , 46 (10) : 2355 -2363 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.10.007

正文

收起

芥蓝（Brassica oleracea var. alboglabra），十字花科芸薹属一年生草本植物，为我国华南地区的特色叶菜类蔬菜，具备种植范围大、市场需求量大等特点。随着生活质量的提升、消费者对蔬菜品质要求日益增高，芥蓝现有品种的产量、适应性、抗性和风味物质含量等需要进一步改良^[1]。

几丁质酶是一种分解几丁质的糖苷水解酶，分布于多种微生物、动物以及植物之中，并于蔬菜作物中广泛存在^[2]。已有多个研究表明，几丁质酶在防御病原真菌侵害、植物应对环境胁迫、植物生长发育的调节、程序性细胞死亡等各种生理过程中起重要作用^[3]，还能一定程度上调节观赏植物的生殖器官发育^[4]。植物的几丁质酶可分布于植物的茎、叶、种子及愈伤组织中^[5]。正常环境条件下，植物中含有的几丁质酶数量较少，活性较低^[6]。但大量研究发现，乙烯（ethylene，ET）、水杨酸（salicylic acid，SA）、1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）等植物激素，干旱胁迫、机械损伤等物理刺激，真菌、细菌、病毒的侵染等均可诱导几丁质酶的产生^[2]。

目前，已有研究通过Markov模型等方法对芥蓝蛋白序列中的几丁质蛋白序列进行基因定位、基因结构和保守基序等分析和预测，共鉴定出20个几丁质酶基因^[7]。然而，其体内调节及外部环境对其表达的影响仍未被系统研究。本研究通过荧光定量qRT-PCR的方法系统地分析植物激素、胡萝卜软腐果胶杆菌以及高温胁迫等因素对18个芥蓝几丁质酶基因的诱导表达，为进一步研究该蛋白的功能及应用提供参考。

1　材料与方法

收起

1.1　材料

本研究所用的芥蓝品种为白花芥蓝（Brassica oleracea cv. BaiHua），种子和供试菌株胡萝卜软腐果胶杆菌巴西亚种（Pectobacterium carotovorum subsp. Brasiliense）均由福州市蔬菜科学研究所提供。

主要试剂：SA、ACC、MeJA购自Sangon Biotech公司；多样本植物RNA提取试剂盒（DNase I）购自雅礼生物（YALI BIOTECH）公司；5×HRbio^TM III RT Master Mix、gDNA Remover、qPCR SYBR Green Master Mix（No Rox）均购自福建荷瑞生物科技有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

仪器与设备：T100 Thermal Cycler梯度PCR仪、Gel Doc XR+凝胶成像系统等购自美国Biorad（伯乐）公司，荧光定量PCR仪购自耶拿分析仪器（上海）有限公司。

1.2　方法

1.2.1　材料种植

芥蓝种植参考曾东琳^[8]的方法，待2片子叶长出，将幼苗移栽至含有混合基质（营养土∶蛭石∶草炭土∶珍珠岩=3∶1∶1∶1）的花盆中，置于智能人工气候室中培养，生长条件：（25±1）℃昼/（22±1）℃夜，16 h光照/8 h黑暗，相对湿度为70%。

1.2.2　诱导处理

选取生长状况良好且长势基本一致的5片真叶期芥蓝植株进行诱导处理，处理前4~5 d，植株在恒温培养室培养，培养条件为：（25±1）℃昼/（22±1）℃夜，16 h光照/8 h黑暗，相对湿度为70%。

预备试验表明，芥蓝接种72 h后叶柄和叶片即出现软腐化，高温处理8 h后植株出现萎蔫，而SA等化学药剂处理72 h后无明显变化，因此参考胡娜娜等^[9]和张筱文^[10]的研究，分别在0、6、24、72 h进行采样。

化学诱导：分别用0.1 mmol/L的SA、0.1 mmol/L MeJA以及1 mmol/L ACC喷雾处理，每个处理3株植株，对照为灭菌双蒸水喷雾。

软腐病原菌诱导：取20 μL软腐菌菌种母液，加入1 mL液体LB进行活化，置于28 ℃的摇床中振荡8~10 h，制备OD₆₀₀为0.6的菌液。用无菌刀片在芥蓝叶柄与叶片相接处交叉割2道长约5 mm、深约2 mm的伤口，取0.5 mL菌液涂抹在伤口处，每个处理3株植株，以LB溶液为对照。

高温诱导：将植株置于恒温培养箱中进行37 ℃高温处理，相对湿度为70%，对照为常温条件生长，每个处理3株。

1.2.3　总RNA提取

取0.05~0.1 mg的叶片组织，在液氮中研磨成粉末，按照YALEPIC多样本植物RNA提取试剂盒（DNase I）说明书提取总RNA。用蛋白核酸检测仪和琼脂糖变性胶凝胶电泳检测RNA纯度。

1.2.4　芥蓝几丁质酶基因家族成员的转录水平分析

按照福建荷瑞公司一步法基因组DNA去除逆转录试剂盒（qPCR专用）的操作说明进行cDNA的制备。反应体系：2 μL Total RNA、4 μL 5×HRbio^TM III RT Master Mix、1 μL gDNA Remover，RNase free H₂O补至20 μL。混匀，42 ℃温育15 min，85 ℃加热5 s灭活逆转录酶。

在Brassicaceae Database（http://www.brassi-cadb.cn/#/）数据可搜索相关基因的CDS序列，随后将序列导入Primer Premier 5软件中进行引物设计，引物由福建福州尚亚生物技术有限公司合成。内参基因BoActin与芥蓝丁质酶基因的PCR引物见表1。qRT-PCR试验参照福建荷瑞公司HRbio qPCR SYBR Green Master Mix（No Rox）试剂盒操作说明书进行，反应体系（20 μL）：HRbio qPCR SYBR Green Master Mix（No Rox）10 μL、正反向引物各0.4 μL、模板1 μL、DEPC处理过的无菌水8.2 μL。反应程序为：94 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火延伸30 s，40个循环。进行3次重复试验。按照2^–ΔΔCt方法对试验数据进行处理，并且求出系统误差。

2　结果与分析

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2.1　SA、ACC、MeJA对芥蓝几丁质酶表达的影响

由图1可知，SA处理后，有17个基因的表达量均出现了显著变化。Bol039802在6 h就开始表达，之后表达量开始回落，至72 h再次升高；Bol035467、Bol040748、Bol35470、Bol007323、Bol030015、Bol035464、Bol007321在24 h时达到最高水平，分别为诱导前的100倍、43倍、30倍、15倍、15倍、15倍、6倍；Bol023322、Bol039802、Bol011420、Bol029467、Bol041024、Bol029469、Bol029470在72 h时达到最高水平，分别为诱导前的38倍、24倍、15倍、14倍、12倍、8倍、5倍。此外，Bol004604、Bol010293、Bol025197在各时间段的变化幅度虽不大，但其表达量水平总体呈现先上升后下降的趋势。结果表明，除Bol030012外，其他基因尤其是Bol035467、Bol040748、Bol35470、Bol023322、Bol039802均能显著被SA诱导表达，可能在SA缓解生物胁迫和非生物胁迫的过程中起重要作用（图2）。

由图3可知，ACC处理后，芥蓝几丁质酶成员中有10个基因的表达量出现了差异变化。Bol035467对ACC反应最为灵敏，在6 h时就快速表达，并于24 h达到最高水平，为诱导前的42倍；Bol030015在72 h达到最高水平，为诱导前的12倍。其余8个基因表达量变化幅度相对不大，其中Bol007323表达量在6 h时升高后回落，至72 h时再次升高；Bol040748、Bol035470在24 h时表达量达到最大；而Bol029469、Bol029470、Bol041024、Bol023322、Bol011420的表达量在72 h时开始升高。结果表明，ACC可以显著诱导Bol035467、Bol030015的表达，促使这些基因参与植物对环境胁迫的响应，并促进果实成熟等生理过程（图4）。

由图5可知，MeJA处理后，有16个芥蓝几丁质酶成员的表达量均出现了显著变化。其中，Bol040748、Bol035464、Bol029470、Bol007321、Bol004604、Bol011420、Bol025197、Bol007323、Bol041024、Bol023322、Bol029469对MeJA表现出高度的敏感，在6 h时表达量达到最高，分别为诱导前的800倍、100倍、60倍、50倍、40倍、22倍、20倍、12倍、12倍、8倍、7倍；Bol035467、Bol035470、Bol030015的表达量在24 h时达到最高水平，分别为诱导前的55倍、25倍、16倍；此外，Bol039802的表达量在72 h时达到最高，约为诱导前的50倍；Bol030012的表达量变化不大，但较诱导前也有所上升。以上结果表明，多数芥蓝的几丁质酶基因均能被植物激素MeJA显著诱导表达，尤其是Bol040748、Bol035464、Bol029470、Bol004604、Bol011420这5个具有高表达量的基因，很可能参与植物抗逆防御过程（图6）。

2.2　软腐菌对芥蓝几丁质酶表达的影响

由图7可知，经软腐菌侵染后，有16个基因的表达量均出现了显著变化。Bol010293、Bol004604、Bol039802、Bol007321、Bol035470对软腐菌反应敏感，在6 h时快速表达，并且表达量达到最高，分别为诱导前的5000倍、160倍、125倍、20倍、7倍；在24 h时，Bol035464、Bol029467、Bol030012、Bol029470、Bol011420、Bol025197、Bol035467表达量达到最高水平，分别为诱导前的150倍、100倍、80倍、70倍、17倍、17倍、12倍；在72 h时，Bol030015、Bol007323、Bol040748、Bol029469的表达量达到最高，分别为诱导前的60倍、30倍、30倍、6倍。这些结果表明，芥蓝的几丁质酶基因能够被软腐菌显著诱导表达，其中高表达量基因Bol010293、Bol004604、Bol035464、Bol039802、Bol029467、Bol020012、Bol020015、Bol029470可能与芥蓝响应软腐菌的侵害密切相关，参与植物抵御病原菌侵害的过程（图8）。

2.3　高温胁迫对芥蓝几丁质酶表达的影响

如图9所示，高温处理后，芥蓝几丁质酶成员中有8个基因均出现显著表达变化。其中，Bol035467在8 h表达量达到最高，为诱导前的2倍；Bol029470、Bol007321、Bol007323、Bol030012、Bol004604、Bol029469、Bol023322在12 h表达量达到最高，分别为诱导前的45倍、14倍、7倍、7倍、4倍、2倍、2倍。结果表明，有一半的芥蓝几丁质酶基因能在高温胁迫的环境中被显著诱导表达，其中Bol029470可能在芥蓝应对高温胁迫中发挥积极的作用（图10）。

3　讨论

收起

目前，植物几丁质酶响应环境胁迫的分子机制已在草莓^[11]、大蒜^[12]、黄瓜^[13]等物种中开展系统性研究，但芥蓝几丁质酶基因的环境信号响应特征尚未被深入解析。ZHU等^[7]在2021年通过全基因组搜索方法共鉴定出20个几丁质酶基因。本研究通过荧光定量qRT-PCR的方法系统地对上述几丁质酶基因进行诱导表达分析，可能是由于品种差异的原因，仅检测到18个芥蓝几丁质酶基因能够对植物激素、胡萝卜软腐果胶杆菌以及高温胁迫产生响应。

SA、ACC、MeJA是对植物生长发育起着重要调节作用的3种植物激素，能够诱导植物进行抗逆性防御表达，以抵抗生物胁迫和非生物胁迫^[14-17]。SA作为广泛存在的酚类化合物，参与植物多种生理过程调控^[18]。ACC作为ET合成的直接前体，其介导的ET信号在促进果实成熟等发育过程发挥关键作用^[14]。MeJA是一种广泛分布于植物各个器官的内源激素，其作为内源信号分子参与植物抗逆防御^[19]，不仅可以激活果蔬抗病途径相关酶活性及相关基因表达，还可以增加次生代谢物质含量以抑制病原菌的生长，从而延缓果蔬采后病害的发生^[20]。前人对芥蓝几丁质酶家族成员启动子区域进行了顺式作用元件进行了预测，发现多个成员的启动子区域存在激素响应元件^[7]。本研究发现，18个芥蓝几丁质酶基因成员均能响应植物激素信号，其中有10个基因（Bol007323、Bol029469、Bol029470、Bol035467、Bol035470、Bol030015、Bol040748、Bol041024、Bol023322、Bol011420）能够同时应答SA、ACC和MeJA三种植物激素，说明这些基因可能构成芥蓝应对多重环境胁迫的共同分子枢纽，这与SA/JA/ET信号既可拮抗又能协同调控防御反应的特性相契合^[3,21-23]。不同植物几丁质酶对化学信号的响应模式也可能存在显著差异。如海岛棉的几丁质酶基因GbCHI能够同时响应SA、ACC、ET的诱导^[24]，而大薯几丁质酶虽未被MeJA/SA诱导表达，但对炭疽菌的抗性有所提高，其可能通过其他防御基因激活提升抗病性^[25]。类似地，本研究结果表明，SA能够显著诱导部分基因的表达，如Bol040748、Bol023322；ACC可以显著诱导Bol040748等基因在6 h内即呈现快速高表达特征；此外，Bol1004604等几丁质酶基因在MeJA处理后表现出快速响应的特征。拟南芥AT3G12500（HCHIB）编码一种碱性几丁质酶，在植物系统获得抗性（SAR）过程中参与乙烯/茉莉酸（ET/JA）介导的信号转导途径。在本研究中，作为AT3G12500的同源基因，Bol035464和Bol035467表现出被MeJA显著诱导的特征，说明它们可能在JA信号调控路径中发挥重要作用。

几丁质酶在植物抗性反应中展现出跨物种功能保守性。研究发现，大白菜抗病品种经霜霉病侵染后特异性诱导几丁质酶基因表达，揭示其在抗病机制中的关键作用^[26]；使用0.2 mmol/L以上浓度的BTH处理可通过显著提升小麦几丁质酶活性，增强幼苗对白粉病的系统抗性^[27]；而西瓜转基因植株通过外源几丁质酶基因的导入，成功建立对镰刀菌枯萎病的防御能力^[28]。软腐病病原菌果胶杆菌属是感染数百种蔬菜和部分观赏性花卉植物造成软腐病最主要的病原菌属，严重制约蔬菜产业的发展^[29-30]。在芥蓝几丁质酶基因成员中，Bol007321、Bol007323、Bol004604等16个基因经软腐菌侵染后的表达水平出现明显变化，说明这些基因可能在芥蓝应对软腐病的抗性反应中发挥重要作用。几丁质是植物病原真菌细胞壁中高度保守的重要组成成分，几丁质酶可以将病原真菌细胞壁中的几丁质降解为几丁质寡糖，进而触发植物免疫反应^[31]，因而传统研究多是探究几丁质酶在植物应对真菌胁迫中的功能。本研究发现，芥蓝几丁质酶家族的大多数成员如Bol1004604、Bol1039802均对细菌性软腐病呈现强烈响应。进一步同源比对显示，这2个基因与拟南芥AT2G43590（PR-3类病原诱导基因）具有高度相似性。虽然其响应的具体机制并不明确，但本研究为拓展几丁质酶在细菌性病害防控中的应用提供新的理论依据。

植物几丁质酶对非生物胁迫的响应已有大量研究，如阿尔比草莓的4个几丁质酶基因FaChi1-FaChi4在干旱胁迫下均呈现诱导表达特征，提示其可能参与果实抗旱调控网络^[10]。芥蓝作为冷敏型作物，其耐热性缺陷严重制约栽培区域拓展^[32]，解析高温响应基因对品种改良具有重要应用价值。本研究发现，8个芥蓝几丁质酶基因（Bol035467、Bol029470、Bol007321、Bol007323、Bol030012、Bol004604、Bol029469、Bol023322）在高温胁迫下呈现显著表达差异，其中Bol029470表现出强烈的诱导效应。该高响应基因的启动子区均含有非生物胁迫响应相关的顺式作用元件^[7]，与本研究中的表达特征形成互证。上述结果为解析芥蓝耐热分子机制及创制耐热新种质提供关键基因资源。

4　结论

收起

几丁质酶作为植物抗逆系统的核心组分，通过双重调控机制参与生物胁迫（病原菌侵染、虫害等）与非生物胁迫（干旱、极端温度等）的防御响应网络，在植物抗性形成过程中发挥枢纽作用^[12]。本研究通过激素处理、病原菌接种和高温胁迫系统处理试验验证发现，芥蓝多数几丁质酶成员具有多重胁迫响应特性，特别是如Bol040748、Bol004604等高响应基因呈现出快速诱导表达特征。这些兼具广谱响应性和时效性的候选基因为后续研究提供重要切入点。后期研究可以从以下方面继续深入展开：（1）解析关键基因在非生物和生物胁迫信号转导中的分子功能和互作网络；（2）建立基因表达模式与抗性表型的定量关联模型；（3）探究十字花科作物抗性调控的新机制，为抗逆分子育种提供理论支撑。

基金

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福建省自然科学基金项目(2022J01589)
国家级大学生创新训练项目(202410389011)

参考文献

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文献

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2025年第46卷第10期

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文章信息

doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.10.007

接收时间：2025-04-03
首发时间：2026-03-09
出版时间：2025-10-25

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出版历史

收稿日期：2025-04-03
录用日期：2025-05-03

基金

福建省自然科学基金项目(2022J01589)

国家级大学生创新训练项目(202410389011)

作者信息

1.福建农林大学园艺学院，福建福州　350002

2.福建省植物功能生物学与绿色农业重点实验室，福建福州　350002

通讯作者:

*吕美玲，E-mail：mllyu@fafu.edu.cn。

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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