热带作物学报

黄瓜绿斑驳花叶病毒MP基因的原核表达及抗血清制备

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任春梅 , 程兆榜 , 杨柳 , 李硕 , 王海涛 , 陆芳 , 季英华 ^*

热带作物学报 | 植物保护与生物安全 2025,46(9): 2181-2189

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热带作物学报 | 植物保护与生物安全 2025, 46(9): 2181-2189

黄瓜绿斑驳花叶病毒MP基因的原核表达及抗血清制备

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任春梅, 程兆榜, 杨柳, 李硕, 王海涛, 陆芳, 季英华^*

作者信息

江苏省农业科学院植物保护研究所，江苏南京　210014

任春梅（1981—），女，硕士，副研究员，研究方向：植物病毒研究。

通讯作者:

^* 季英华（JI Yinghua），E-mail：2547661128@qq.com。

Prokaryotic Expression and Antiserum Preparation of the Movement Protein Gene of Cucumber Green Mosaic Virus

Chunmei REN, Zhaobang CHENG, Liu YANG, Shuo LI, Haitao WANG, Fang LU, Yinghua JI^*

Affiliations

Institute of Plant Protection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing, Jiangsu 210014, China

出版时间: 2025-09-25 doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.09.016

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摘要

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黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）是危害瓜类作物的重要植物病毒之一，其运动蛋白（movement protein，MP）在病毒传播和致病过程中起关键作用。本研究通过RT-PCR克隆CGMMV的MP基因，构建原核表达载体pET-32a-MP，并在大肠杆菌BL21（DE3）中成功诱导表达分子量约48 kDa的重组MP融合蛋白。利用镍柱亲和层析纯化获得高纯度蛋白（纯度≥80%），以此免疫新西南大白兔制备多克隆抗体。Western blot和ELISA分析表明，抗血清效价达409 600，且能特异性识别CGMMV侵染叶片中的MP蛋白，与烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus，WMV）等其他病毒无交叉反应。本研究实现了CGMMV MP蛋白的原核高效表达与特异性抗体制备，为病毒快速检测、免疫组织化学及蛋白功能研究提供重要工具，对保障瓜类作物安全生产具有重要意义。

关键词

黄瓜绿斑驳花叶病毒 / 运动蛋白 / 原核表达 / 抗血清

Abstract

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Cucumber green mottle mosaic virus (CGMMV) is one of the important plant viruses that harm melon crops, and its movement protein (MP) plays a key role in virus transmission and pathogenicity. This study cloned the MP gene of CGMMV through RT-PCR, constructed the prokaryotic expression vector pET-32a-MP, and successfully induced the expression of a recombinant MP fusion protein with a molecular weight of approximately 48 kDa in Escherichia coli BL21 (DE3). Purification of high purity protein (purity degree≥80%) using nickel column affinity chromatography was used to prepare polyclonal antibodies against the New Southwest White Rabbit. Western blot and ELISA analysis showed that the titer of the anti serum reached 409 600, and it could specifically recognize the MP protein in CGMMV infected leaves, without cross reactivity with other viruses such as Tobacco mosaic virus (TMV) and Watermelon mosaic virus (WMV). The study would provide important tools for rapid virus detection, immunohistochemistry, and protein function research, which is of great significance for ensuring the safe production of melon crops.

Key words

Cucumber green mottled mosaic virus / sports protein / prokaryotic expression / antiserum

引用本文

任春梅, 程兆榜, 杨柳, 李硕, 王海涛, 陆芳, 季英华. 黄瓜绿斑驳花叶病毒MP基因的原核表达及抗血清制备. 热带作物学报, 2025 , 46 (9) : 2181 -2189 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.09.016

Chunmei REN, Zhaobang CHENG, Liu YANG, Shuo LI, Haitao WANG, Fang LU, Yinghua JI. Prokaryotic Expression and Antiserum Preparation of the Movement Protein Gene of Cucumber Green Mosaic Virus[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2025 , 46 (9) : 2181 -2189 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.09.016

正文

收起

黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）隶属于帚状病毒科（Virgaviridae）烟草花叶病毒属（Tobamovirus）^[1]，是一种主要危害瓜类作物的重要植物病毒，其典型症状表现为叶片斑驳、褪绿及果实畸形等，影响瓜类作物的产量和品质，对瓜类作物的产业安全构成严重威胁^[2-3]。目前，全球范围内已有超过20个国家报道过CGMMV发生^[4]，我国自2005年在辽宁省盖州市首次发现西瓜植株感染该病毒以来^[5]，已在广西^[6]、广东^[7]、湖南^[8]、云南^[9]、海南^[10]、山东^[11]、甘肃及上海^[12]等地形成区域性流行。本实验室自2012年在江苏地区开展CGMMV的调查结果也显示，CGMMV已在江苏成功定殖并形成稳定的种群分布，其中设施栽培西瓜上危害最为严重，常连片发生，重病田损失率达50%以上，严重影响了江苏省西甜瓜的安全生产^[13-14]。

CGMMV病毒粒子为直棒状，无膜^[15]，是一种正义线性单链RNA病毒，基因组全长约为6400 bp，分别编码129 kDa复制酶、186 kDa复制酶、29 kDa运动蛋白（movement protein，MP）和17.4 kDa外壳蛋白（coat protein，CP）^[16]。其中MP蛋白除在病毒致病过程中起作用外，主要参与病毒粒子在细胞间的移动^[17]。有研究表明同属的烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）胞间运动是以MP与病毒核糖核蛋白形成复合体的形式运输的^[18]，并且在长距离运输中有多个寄主因子参与^[19]，至于CGMMV的MP是否有相似的功能尚不明确，因此本研究借助原核表达技术在体外表达高质量MP蛋白并制备特异性抗血清，以应用于该蛋白的功能研究。

原核表达系统已广泛应用于植物病毒的蛋白表达中，运动蛋白的原核表达研究多聚焦于可溶性表达优化及高纯度抗原制备，如马秋萌等^[20]、刘玉姿等^[21]、胡汝检等^[22]、尚卫娜等^[23]分别对玉米黄花叶病毒、甘蔗黄叶病毒、大麦黄矮病毒PAV青海分离物、番茄斑萎病毒的MP蛋白进行了原核表达，制备了高效价特异性抗血清，研究发现融合标签的选择及纯化策略对蛋白活性和抗体特异性至关重要。针对CGMMV外壳蛋白的原核表达及抗血清制备已有相关报道^[24]，而CGMMV运动蛋白的原核表达尚无研究，因此本研究将CGMMV-MP基因与pET-32a载体结合，通过优化诱导条件显著提高融合蛋白表达量；同时，采用镍柱亲和层析结合尿素复性技术，高效纯化包涵体形式的重组蛋白，制备高效价且高特异性的多克隆抗体，为CGMMV的免疫检测及后续功能研究提供关键技术支撑。

1　材料与方法

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1.1　材料

CGMMV毒源采集于海南省万宁市长丰镇一生产田中具有典型CGMMV侵染症状的西瓜病叶，经分子检测和致病性回接为CGMMV阳性，将该分离物命名为CGMMV-HaiN12，病叶干燥保存于‒70 ℃冰箱中备用。新西兰大白兔由江苏省农业科学院兽医研究所提供。

总RNA提取试剂盒及M-MLV反转录酶购自美国Fermentas公司；大肠杆菌表达系统包含Trans10感受态细胞及BL21（DE3）蛋白表达菌株，均购自北京全氏金生物技术有限公司；克隆载体pET-32a（+）由本实验室保存；pMD-19T载体及配套酶体系（T4 DNA Ligase、限制性内切酶等）购自日本TaKaRa公司；表达载体pET-32a（+）由本实验室保存；pMD-19T载体、T4 DNA连接酶、DNA限制性内切酶等购自TaKaRa公司；碱性磷酸酶标记的抗兔IgG二抗、弗氏完全及不完全佐剂均购自Sigma公司；硝酸纤维素膜（PVDF，0.45 μm孔径）购自Pall公司；His-tag亲和层析介质Ni-NTA Agarose购自QIGEN公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2　方法

1.2.1　CGMMV-MP基因的克隆及序列分析

根据CGMMV-HaiN12（GenBank登录号为KC852074）的全基因序列设计MP基因引物，上游引物：5′‒CGggatccATGTCTCTAAGTAAGGTGTCAG‒3′（下划线处为BamHⅠ酶切位点）；下游引物：5′‒GCgtcgacCTAGGTGTGATCGGATTGT‒3′（下划线处为SalⅠ酶切位点），由Invitrogen公司合成。采用总RNA提取试剂盒提取叶片总RNA，利用反转录试剂盒PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）合成cDNA，具体方法步骤按说明书进行。

以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系如下：LA Taq（5 U/µL）0.5 μL，10×LA PCR BufferⅡ（Mg²⁺ Free）5 µL，MgCl₂（25 mmol/L）5 µL，高纯dNTPs（均为2.5 mmol/L）8 µL，cDNA模板1 µL，上下游引物（20 µmol/L）各1 µL，0.1% DEPC水29.5 µL。PCR反应参考王峰等^[10]关于CGMMV 3条片段扩增程序进行。PCR产物经试剂盒回收和纯化后连接至pMD-19T载体，蓝白斑筛选阳性克隆后送南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。测定序列提交NCBI网站，应用BLASTn进行序列同源性比对，并基于比对结果构建系统发育树并计算同源性指数。

1.2.2　CGMMV-MP基因原核表达载体的构建

对pMD-19T-MP克隆载体及pET-32a（+）表达载体分别进行BamH I与Sal I核酸限制性酶双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳分离回收MP基因片段和表达载体，经T4 DNA连接酶16 ℃连接过夜后将其转化大肠杆菌Trans 10，然后在含有氨苄青霉素的平板上挑取重组克隆，PCR分析插入基因的完整性，酶切验证重组质粒构型的正确性，并对阳性克隆进行DNA测序分析比对序列一致性，验证成功的重组表达载体命名为pET-32a-MP，-80 ℃超低温冻存备用。

1.2.3　CGMMV-MP基因的诱导表达

将验证正确的重组表达载体pET-32a-MP及空载体pET-32a（+）分别导入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，通过抗生素抗性筛选获得阳性克隆。选取单个菌落接种于3 mL含100 µg/mL Amp的LB液体培养基中，在37 ℃恒温摇床中以180 r/min转速培养过夜，再按1∶100体积比稀释至新鲜LB培养基中，继续培养至菌液OD₆₀₀值达到0.8~1.0，添加IPTG（终浓度0.5 mmol/L），将培养体系转移至28 ℃恒温摇床中继续振荡培养3 h。同时设置未添加IPTG诱导的pET-32a-MP为阴性对照，用于验证基础水平表达。于4 ℃下12 000 r/min离心15 min，弃上清液，用预冷的0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH 8.0）重悬菌体至原始体积的1/10。超声破碎处理（400 W，超声2 s，间隔5 s，循环60次），期间保持样本温度不超过4 ℃。再以12 000 r/min高速离心10 min，分离得到上清液（可溶性蛋白组分）和沉淀（包涵体）。分别向上清液和沉淀中加入2×SDS蛋白上样缓冲液，充分混匀后煮沸5 min变性。通过SDS-PAGE分析目标蛋白在可溶性和包涵体中的表达情况。

1.2.4　表达蛋白的可溶性分析及纯化

含有重组质粒pET-32a-MP的BL21（DE3）菌株接种于含氨苄青霉素（终浓度100 µg/mL）的培养基中。在37 ℃、180 r/min条件下震荡培养，待菌液OD₆₀₀值达到0.8~1.0区间时，加入IPTG（终浓度0.5 mmol/L）诱导表达4 h，于4 ℃下12 000 r/min离心15 min收集菌体细胞。再采用超声波破碎仪（功率50 W，脉冲3 s×5 s，冰浴环境）进行细胞裂解处理，裂解完成后进行差速离心分别收集上清液（可溶性蛋白）和沉淀（包涵体），分别取上清液和沉淀溶解液进行SDS-PAGE分析。上清液加至预先平衡的Ni²⁺-NTA亲和层析柱，4 ℃条件下振荡吸附1 h，依次用20 mmol/L咪唑和100 mmol/L咪唑洗脱^[25]，采用SDS-PAGE分析蛋白洗脱情况。洗脱液在4 ℃ PBS缓冲液（pH 8.0）中透析24 h以去除残留小分子杂质。透析产物通过冷冻干燥浓缩至适当浓度，经SDS-PAGE电泳分析纯度。

1.2.5　表达蛋白的抗血清制备及效价测定

通过Bradford法蛋白浓度定量试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）测定纯化蛋白的浓度；参考季英华等^[26]的方法皮下和肌肉混合多点注射雄性大耳白兔，共免疫6次，每周免疫1次，每次免疫蛋白量为0.5 mg。选取健康成年兔耳缘静脉采集2 mL基础血清，经4 ℃静置12 h后，离心获取阴性对照血清，‒20 ℃冻存备用。初级免疫阶段（前3次）采用多点皮下及肌肉联合注射：首次免疫将纯化蛋白与等体积的氟氏完全佐剂充分乳化后注射，第2、3次将蛋白与等体积的氟氏不完全佐剂充分乳化后注射；强化免疫阶段（后3次）采用静脉注射：连续3周静脉注射无佐剂抗原。末次免疫14 d后心脏采血。血样4 ℃放置过夜，于8000 r/min离心10 min所得上清即为抗血清。参考商海丽等^[27]的方法采用间接ELISA法测定抗体效价，以免疫前健康兔血清作为阴性对照，用0.01 mol/L PBST连续倍比稀释（100×2¹~100×2¹⁵）多克隆抗体和阴性血清，每个梯度设置3个重复，通过酶标仪检测抗血清效价。

1.2.6　多克隆抗体的特异性分析

参考熊如意等^[28]的Western blot印记法检测多抗的特异性，分别准备感染CGMMV、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus，WMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）的叶片和健康叶片，参考马秋萌等^[20]的方法提取植物总蛋白，加人100 µL十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）蛋白上样缓冲液，在100 ℃的水浴锅中加热10 min，于12 000 r/min离心10 min，取上清液进行SDS-PAGE电泳检测。然后转印至PVDF膜上，以多克隆抗体Anti-MP为一抗，碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG为二抗，用BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒进行显色，显现清晰条带后加去离子水终止反应并拍照。

2　结果与分析

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2.1　CGMMV-MP基因的克隆

提取CGMMV-HaiN12的RNA，经反转录试剂盒合成cDNA，以此为模板，用设计的MP基因引物PCR扩增后，在800 bp左右获得了与预期大小相近的片段，其电泳检测结果见图1A。将回收纯化的MP基因连接到pMD19-T Vector上，转化Trans10化学感受态细胞，经蓝白斑筛选，提取质粒，并用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切鉴定，在800 bp附近切出一条条带（图1B），与MP基因大小相近。

2.2　CGMMV-MP基因原核表达载体的构建

将重组原核表达质粒pET-32a-MP进行电泳检测，质粒大小和预期大小相符（图2）。将质粒用BamHⅠ和SalⅠ双酶切鉴定，在800 bp左右切出目的条带（图2），说明MP基因已克隆到原核表达载体pET-32a上。

将双酶切鉴定正确的重组原核表达质粒送南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序，测序结果经BioEdit v 7.0.9比对拼接，显示所测定核酸序列与CGMMV-HaiN12的MP基因核苷酸序列一致性达100%，所克隆的MP基因阅读框架均正确（图3），说明构建的pET-32a-MP原核表达质粒正确。

2.3　CGMMV-MP融合蛋白的诱导表达

将重组原核表达质粒pET-32a-MP转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，挑取单菌落于LB液体培养基中培养，并用终浓度为0.5 mmol/L的IPTG诱导表达后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，与未诱导和空载体2个对照相比，在约48 kDa附近出现特异性条带（图4），但是表达量较低。按CGMMV的MP基因的阅读框架，MP蛋白分子量大小约为29 kDa，加上融合蛋白表达的1个Trx Tag、1个His Tag和1个S Tag的约19 kDa的标签，共约48 kDa，这与预期融合蛋白分子量相当，表明MP基因已经在大肠杆菌BL21（DE3）中成功融合表达。经过原核表达条件的优化，当OD₆₀₀为1.5，IPTG浓度为1.0 mmol/L时，MP融合蛋白的表达量最高（图5）。

2.4　CGMMV-MP融合蛋白的纯化

MP融合蛋白基本上以包涵体的形式存在（图6A）。MP融合蛋白聚集成的包涵体经超声破碎、反复洗涤，与可溶性蛋白和膜结合蛋白等细菌蛋白分离后，溶于8.0 mol/L尿素，再经镍柱亲和层析，在250 mmol/L洗脱缓冲液中洗脱2次后，MP融合蛋白纯度达到80%以上（图6B），可直接用作抗原。应用北京百泰克生物技术有限公司的Bradford法蛋白定量试剂盒测定提纯的MP融合蛋白的浓度，MP融合蛋白浓度为0.5 mg/mL。

2.5　抗血清anti-MP的效价测定

固定抗原浓度，抗血清Anti-MP从100倍开始稀释，二倍比稀释，采用间接ELISA法检测Anti-MP效价，每个抗体稀释倍数重复3次，同时倍比稀释免疫前的兔血清作为阴性对照（CK）。根据ELISA测定评价标准，在抗血清Anti-MP稀释倍数为409 600时，OD₄₀₅Anti-MP/OD₄₀₅CK= 2.35，鉴定为阳性；而当稀释倍数为819 200时，OD₄₀₅Anti-MP/OD₄₀₅CK=1.81，鉴定为阴性（图7），因此抗血清Anti-MP的效价为409 600，表明用纯化的CGMMV-MP融合蛋白制备的抗血清具有很高的效价。

2.6　Western blot分析

用Anti-MP对MP原核表达产物进行Western blot分析（图8），Anti-MP能与pET-32a空载体诱导菌体蛋白在19 kDa附近发生特异性反应，与pET-32a-MP诱导菌体总蛋白在48 kDa附近处发生特异性反应，能与纯化的MP融合蛋白也发生反应。说明Anti-MP可以特异性地和MP融合蛋白及表达的标签相结合。

再通过Anti-MP对CGMMV侵染寄主叶片的总蛋白进行Western blot检测（图9），结果发现该抗体在预期大小位置发生抗体反应，检测到MP蛋白。而与健康对照叶片、TMV、WMV和CMV侵染叶片无交叉反应，说明Anti-MP只能结合CGMMV的MP蛋白，具有较好的特异性。

3　讨论

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黄瓜绿斑驳花叶病毒作为一种可种传的外来入侵有害生物，近年来已在我国多个省份的葫芦科作物种植区引发严重疫情，造成了巨大的经济损失。鉴于该病毒可通过宿主种子进行有效传播的特性及其对产业构成的实质性威胁，我国于2007年正式将其列为国家农业植物检疫对象。根据当年农业部颁布的第862号公告要求，相关部门已建立起针对带毒葫芦科作物种子、种苗的强制性检疫管控体系，明确禁止或严格管控相关农业繁殖材料的跨区域调运与流通，以遏制病原体的扩散蔓延^[29]。近些年，CGMMV仍在我国蔓延危害，根据笔者近年来在江苏省对CGMMV的调查发现，全省病害发生面积最高达35.8 hm²，主要危害西瓜，由种子调运传入，病害突发连片发生，病害的发生强度上设施作物大于露地作物，究其原因可能与设施农业农事操作频繁，病毒易于传播侵染，一旦定殖难根治等相关。

本研究利用RT-PCR方法扩增和克隆了CGMMV-HaiN12的MP基因，成功构建了原核表达质粒pET-32a-MP，并在大肠杆菌BL21（DE3）中成功表达了CGMMV-HaiN12的MP蛋白。SDS-PAGE及Western blot分析表明，所得MP融合蛋白主要呈现包涵体形态特征。这是因为采用高温诱导策略（通常为42 ℃）时，菌体增殖速率显著提升（约提高3~5倍），导致mRNA翻译效率呈指数级增长。这种快速的蛋白合成过程使得细胞内的折叠辅助机制处于超负荷状态，进而造成新生肽链的错误折叠与聚集从而形成包涵体^[30]。此外，IPTG的浓度直接影响大肠杆菌生长速率和蛋白表达效率^[31]。本研究通过系统优化确定1.0 mmol/L IPTG、OD₆₀₀为1.5时蛋白表达量最多，所得融合蛋白表达量显著高于张正坤等^[32]采用0.4 mmol/L IPTG诱导TMV-MP表达蛋白的表达量。然后通过复性获得了可溶性蛋白，不仅恢复了外源蛋白的完整高级空间结构，而且通过去除宿主菌自身蛋白而实现了纯化^[33]。

进一步以纯化的MP融合蛋白为抗原免疫家兔，制备了MP蛋白高效价的抗血清Anti-MP，效价为1∶409 600，这一效价显著高于已报道的GGMMV-CP抗血清（效价为1∶1024）^[24]、TMV-MP多克隆抗体（效价为1∶51 200）^[33]和玉米黄花叶病毒MP抗血清（效价为1∶102 400）^[20]。Western blot分析显示其与TMV、WMV等近缘病毒无交叉反应，能特异性识别CGMMV侵染叶片中的MP蛋白，验证了该原核表达蛋白的体外活性，这一高特异性可能源于纯化过程中对宿主杂蛋白的严格去除（纯度≥80%）及抗原表位的完整保留，为开发高灵敏度的CGMMV免疫检测试剂盒奠定基础。

目前的研究表明CMV的2b蛋白^[34]和PVX的MP蛋白^[35]为基因沉默抑制子；TMV的MP蛋白不仅可诱导基因沉默，主要在病毒粒子胞间移动和长距离运输中发挥重要作用^[36-37]。CGMMV的MP蛋白无论在氨基酸序列保守性和功能域特征均与TMV的MP蛋白、CMV的2b蛋白具有相似性，但其是否具有类似转录后基因沉默抑制功能仍需进一步验证。郑海刚等^[38]证明了CGMMV的MP蛋白具备干扰宿主转录后基因沉默的潜能。本研究成功实现CGMMV-MP的原核高效表达及抗体制备，为解析MP蛋白的细胞间运输机制及开发基于抗体的快速检测技术提供了重要工具。未来可进一步利用该抗体探索MP在病毒侵染早期的动态分布，或通过免疫共沉淀筛选其互作宿主因子。

基金

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现代农业产业技术体系
国家西甜瓜产业技术体系(CARS-25-2025-G20)

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文献

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2025年第46卷第9期

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文章信息

doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.09.016

接收时间：2025-03-18
首发时间：2026-03-07
出版时间：2025-09-25

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作者

出版历史

收稿日期：2025-03-18
录用日期：2025-05-14

基金

现代农业产业技术体系

国家西甜瓜产业技术体系(CARS-25-2025-G20)

作者信息

江苏省农业科学院植物保护研究所，江苏南京　210014

通讯作者:

^* 季英华（JI Yinghua），E-mail：2547661128@qq.com。

参考文献

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/rdzwxb/CN/10.3969/j.issn.1000-2561.2025.09.016

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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