热带作物学报

引物名称 Primer name	序列（5′–3′） Sequence（5′–3′）	扩增产物长度 Length of amplification product/nt	用途 Purpose
SL12	CACGGTTTCCGGTGTATGCT	1058	SLCMV nested PCR detection
SL13	CCTGGCGTTTCTTGAGGGTAT
CP1F	AACTTCGACAGCCCATACAG	287
CP1R	AGGATATAAACGGACTTAACGC
SLCMV-QF638	AGCAAGAGGCTGGCAAGTATGA	62	TaqMan qPCR detection
SLCMV-QR699	ACACGCCATGTACAGCATCAA
Probe-661	AATCATACCGAGAATGC	17

引物名称 Primer name	序列（5′–3′） Sequence（5′–3′）	扩增产物长度 Length of amplification product/nt	用途 Purpose
SL12	CACGGTTTCCGGTGTATGCT	1058	SLCMV nested PCR detection
SL13	CCTGGCGTTTCTTGAGGGTAT
CP1F	AACTTCGACAGCCCATACAG	287
CP1R	AGGATATAAACGGACTTAACGC
SLCMV-QF638	AGCAAGAGGCTGGCAAGTATGA	62	TaqMan qPCR detection
SLCMV-QR699	ACACGCCATGTACAGCATCAA
Probe-661	AATCATACCGAGAATGC	17

标准品拷贝数 Standard copy number/（copies·μL^-1）	组内重复性试验Intra-group repeat test	组间重复性试验Inter-group repeat test
4.5×10⁶	33.72±0.18	0.53	34.18±0.37	1.08
4.5×10⁷	33.41±0.28	0.84	32.62±0.52	1.58
4.5×10⁸	30.79±0.25	0.81	30.55±0.34	1.11
4.5×10⁹	28.42±0.22	0.77	28.28±0.19	0.67

标准品拷贝数 Standard copy number/（copies·μL^-1）	组内重复性试验Intra-group repeat test	组间重复性试验Inter-group repeat test
4.5×10⁶	33.72±0.18	0.53	34.18±0.37	1.08
4.5×10⁷	33.41±0.28	0.84	32.62±0.52	1.58
4.5×10⁸	30.79±0.25	0.81	30.55±0.34	1.11
4.5×10⁹	28.42±0.22	0.77	28.28±0.19	0.67

样品编号 Sample No.	品种/种质 Variety/Germplasm	来源 Origin	巢式 PCR Nested PCR	TaqMan qPCR	拷贝数 Copy number/copies·g^-1
HP24101	桂热13	广西合浦	–	+	1.16×10⁶
HP24102	6068		–	+	9.04×10⁵
HP24103	NZ199		–	+	6.45×10⁵
HP24104	沙田面包		–	+	7.40×10⁵
HP24105	SC205		–	+	6.10×10⁵
HP24106	实生5号		+	+	2.00×10⁸
HP24107	实生1号		+	+	2.15×10⁶
HP24108	V04-19		–	+	6.55×10⁵
HP24109	华南9		–	+	1.53×10⁶
HP24110	桂热10		–	+	2.22×10⁷
HP24111	YB201		–	+	7.10×10⁷
HP24112	A09-24		–	+	5.00×10⁸
HP24113	RXC09		–	–	0
HP24114	V06-31		–	+	1.06×10⁶
HP24115	面包木薯		–	+	1.43×10⁵
HP24116	杂NK-10		+	+	4.09×10¹¹
HP24117	NK-10-8		+	+	4.19×10⁸
HP24118	实生5号		+	+	1.35×10⁸
HP24119	NK-10-1		+	+	3.98×10¹¹
HP2420	YB201		+	+	7.25×10⁷
HP2421	TCGRI028		–	+	1.56×10⁷
HP2422	桂11		–	+	1.96×10⁶
DT2401	F499	福建大田	+	+	1.78×10⁶
DT2402	GR911		–	+	6.70×10⁵
DT2403	沙田		–	–	0
DT2404	A05-138		–	+	2.57×10⁸
DT2405	C		+	+	3.11×10⁶
DT2406	YB69		+	+	1.14×10⁸
DT2407	NZ199		+	+	5.04×10⁸
DT2408	V4-8		+	+	1.32×10⁷
DT2409	49		+	+	3.04×10⁸
DT2410	NZ199		+	+	7.00×10⁸
DT2411	V4-8		+	+	1.88×10⁹
DT2412	49		+	+	1.01×10⁶
DT2413	NZ199		+	+	3.37×10⁸
DT2414	A		+	+	3.69×10⁸

样品编号 Sample No.	品种/种质 Variety/Germplasm	来源 Origin	巢式 PCR Nested PCR	TaqMan qPCR	拷贝数 Copy number/copies·g^-1
HP24101	桂热13	广西合浦	–	+	1.16×10⁶
HP24102	6068		–	+	9.04×10⁵
HP24103	NZ199		–	+	6.45×10⁵
HP24104	沙田面包		–	+	7.40×10⁵
HP24105	SC205		–	+	6.10×10⁵
HP24106	实生5号		+	+	2.00×10⁸
HP24107	实生1号		+	+	2.15×10⁶
HP24108	V04-19		–	+	6.55×10⁵
HP24109	华南9		–	+	1.53×10⁶
HP24110	桂热10		–	+	2.22×10⁷
HP24111	YB201		–	+	7.10×10⁷
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HP24118	实生5号		+	+	1.35×10⁸
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DT2413	NZ199		+	+	3.37×10⁸
DT2414	A		+	+	3.69×10⁸

样品编号 Sample No.	拷贝数 Copy number	样品编号 Sample No.	拷贝数 Copy number
Bt241201	3.03×10⁵	Bt241208	0
Bt241202	2.34×10⁶	Bt241209	3.48×10⁶
Bt241203	9.42×10⁴	Bt241210	5.13×10⁷
Bt241204	1.461×10⁵	Bt241211	2.33×10⁹
Bt241205	0	Bt241212	1.641×10⁹
Bt241206	5.79×10⁵	Bt241213	1.545×10⁹
Bt241207	2.898×10⁵	Bt241214	6.285×10⁵

样品编号 Sample No.	拷贝数 Copy number	样品编号 Sample No.	拷贝数 Copy number
Bt241201	3.03×10⁵	Bt241208	0
Bt241202	2.34×10⁶	Bt241209	3.48×10⁶
Bt241203	9.42×10⁴	Bt241210	5.13×10⁷
Bt241204	1.461×10⁵	Bt241211	2.33×10⁹
Bt241205	0	Bt241212	1.641×10⁹
Bt241206	5.79×10⁵	Bt241213	1.545×10⁹
Bt241207	2.898×10⁵	Bt241214	6.285×10⁵

斯里兰卡木薯花叶病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

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黄境珊 ¹^,² , 王国芬 ² , 时涛 ² , 李超萍 ² , 陈奕鹏 ² , 蔡吉苗 ² , 李博勋 ² , 刘先宝 ² , 黄贵修 ²^,³^,^*

热带作物学报 | 组学与生物技术 2025,46(9): 2056-2062

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热带作物学报 | 组学与生物技术 2025, 46(9): 2056-2062

斯里兰卡木薯花叶病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

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黄境珊¹^,², 王国芬², 时涛², 李超萍², 陈奕鹏², 蔡吉苗², 李博勋², 刘先宝², 黄贵修²^,³^,^*

作者信息

^1.黑龙江八一农垦大学农学院，黑龙江大庆　163319

^2.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业农村部热带作物有害生物综合治理重点实验室/海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室，海南海口　571101

^3.中国热带农业科学院三亚研究院/热带作物生物育种全国重点实验室，海南三亚　572024

黄境珊（1997—），女，硕士研究生，研究方向：植物病理学。

通讯作者:

^* 黄贵修（HUANG Guixiu），E-mail：hgxiu@vip.163.com。

Establishment and Application of TaqMan Fluorescence Quantitative PCR (TaqMan qPCR) Detection Method of Sri Lankan Cassava Mosaic Virus

Jingshan HUANG¹^,², Guofen WANG², Tao SHI², Chaoping LI², Yipeng CHEN², Jimiao CAI², Boxun LI², Xianbao LIU², Guixiu HUANG²^,³^,^*

Affiliations

^1.College of Agriculture, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Daqing, Heilongjiang 163319, China

^2.Environment and Plant Protection Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops, Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests, Haokou, Hainan 571101, China

^3.Sanya Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/State Key Laboratory of Tropical Crop Breeding, Sanya, Hainan 572024, China

出版时间: 2025-09-25 doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.09.003

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摘要

收起

由斯里兰卡木薯花叶病毒（Sri Lankan cassava mosaic virus，SLCMV）侵染引起的斯里兰卡木薯花叶病是近年来我国木薯种植中新发的危险性病害。现有检测技术存在灵敏度低、效率不高等不足，限制了相关工作的开展。本研究根据病毒基因序列设计引物和探针，制备阳性质粒标准品，建立SLCMV的TaqMan荧光定量检测技术，并对其应用效果等进行验证。结果发现，该方法仅对SLCMV DNA样品产生特异性荧光信号，对阳性质粒标准品的最低检出量为4.5×10¹ copies/μL。标准曲线显示，C_t值与拷贝数的对数呈良好线性关系，曲线斜率为-3.1312，相关系数（R²）为0.9969，扩增效率（E）为97.9%，标准曲线方程为y=-3.1312x+34.599。利用该技术对广西和福建的2个木薯种植园供试样品进行检测，叶片阳性检出率分别达95.45%和78.57%，最低检测拷贝数为1.45×10⁵ copies/g，而田间烟粉虱携毒率为86%，最低带毒量为9.42×10⁴ copies/头。该技术具有良好的灵敏度、特异性和重复性，可为该病的田间鉴定、早期诊断、无毒种茎评价等监控工作提供有效的技术支持。

关键词

木薯 / 斯里兰卡木薯花叶病毒 / TaqMan荧光定量PCR

Abstract

收起

Sri Lankan cassava mosaic disease, caused by Sri Lankan cassava mosaic virus (SLCMV), is a recently emerging dangerous disease in China. Existing detection methods of SLCMV are constrained by low sensitivity and poor efficiency, impeding related research and applications. Primers and probes were designed according to the gene sequences of the SLCMV, and a positive plasmid standard was prepared. The TaqMan fluorescence quantitative detection technology for SLCMV was established, and its application effect was verified. The method only generated specific fluorescence signals for SLCMV DNA samples, and the minimum detectable amount of the positive plasmid standard was 4.5×10¹ copies/μL. The standard curve showed that there was a good linear relationship between the C_t value and the logarithm of the copy number. The slope of the curve was –3.1312, the correlation coefficient R² was 0.9969, the amplification efficiency (E) was 97.9%, and the equation of the standard curve was y=–3.1312x+34.599. Using this technology to detect the tested samples from two cassava plantations in Guangxi and Fujian, the positive detection rate of leaves was 95.45% and 78.57%, respectively, and the minimum detectable copy number was 1.45×10⁵ copies/g. The virus-carrying rate of Bemisia tabaci in the field was 86%, and the minimum virus-carrying amount was 9.42×10⁴ copies/B. tabaci. This technology has good sensitivity, specificity, and repeatability, and could provide effective technical support for the monitoring and control work such as field identification, early diagnosis, and evaluation of virus-free stem cuttings of the disease.

Key words

cassava / Sri Lankan cassava mosaic virus / TaqMan qPCR

引用本文

黄境珊, 王国芬, 时涛, 李超萍, 陈奕鹏, 蔡吉苗, 李博勋, 刘先宝, 黄贵修. 斯里兰卡木薯花叶病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用. 热带作物学报, 2025 , 46 (9) : 2056 -2062 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.09.003

Jingshan HUANG, Guofen WANG, Tao SHI, Chaoping LI, Yipeng CHEN, Jimiao CAI, Boxun LI, Xianbao LIU, Guixiu HUANG. Establishment and Application of TaqMan Fluorescence Quantitative PCR (TaqMan qPCR) Detection Method of Sri Lankan Cassava Mosaic Virus[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2025 , 46 (9) : 2056 -2062 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.09.003

正文

收起

木薯（Manihot esculenta）属于大戟科木薯属，原产于南美洲亚马孙平原南部边缘，目前在热带和部分亚热带地区广泛种植。木薯块根肉质，富含淀粉，被誉为“淀粉之王”“地下粮仓”，与马铃薯、甘薯并称为世界三大薯类，也是全球第六大粮食作物。木薯在我国华南地区广泛种植，鲜薯收获后，除少量直接鲜食或饲用外，主要用作工业原料，可加工出多达3000种产品，覆盖人民生活的各个领域^[1]。目前，广西是国内木薯最大的种植区域，海南、广东等地区也是重要的种植区^[2]。

斯里兰卡木薯花叶病毒（Sri Lankan cassava mosaic virus，SLCMV）属于双生病毒科（Geminivieidae）菜豆金黄花叶病毒属（Begomovirus），是已知11种木薯花叶双生病毒（Cassava Mosaic geminiviruses，CMGs）中的一种。SLCMV侵染后，首先在发病叶片部分部位出现褪绿、黄化，随后扩大且出现类似“花叶”的症状，典型症状为叶片黄化、皱缩畸形及斑驳等症状。SLCMV主要通过带毒种茎进行远距离传播^[3]，田间条件下主要通过烟粉虱进行短距离扩散^[4]。该病毒引起的斯里兰卡木薯花叶病毒病（Sri Lankan cassava mosaic disease，SLCMD）是亚洲地区重要的木薯病害，近年来在东南亚地区的木薯园内发生严重为害^[5]。2018年，本团队首次在海南儋州和澄迈发现该病害^[6]，随后调查发现该病在主要种植区均有零星发生，已经成为国内木薯种植业及相关产业发展的潜在威胁。

SLCMV的早期检测对于病害的田间防控工作具有重要的指导意义。王国芬等^[7]初步建立了SLCMV的常规检测技术，周司珊^[8]进一步开展了巢式PCR检测技术的研究和应用工作。AYAKA等^[9]、ARUTSELVAN等^[10]先后开展了SLCMV的环介导等温扩增（loop-mediated isothermal ampliffcation，LAMP）检测技术研究，并获得灵敏度比常规方法高100倍的效果。SLCMD为我国木薯新发病害，常规PCR和巢式PCR检测方法存在灵敏度低、效率不高等不足，而LAMP技术常获得假阳性结果^[10]，对于新发病害并不适用。因此，本研究基于SLCMV外壳蛋白AV1基因保守序列，设计引物和探针，开展TaqMan荧光定量PCR（TaqMan qPCR）检测技术的研发工作，旨在为该病害的早期诊断和有效防控提供技术支持。

1　材料与方法

收起

1.1　材料

1.1.1　样品采集

木薯叶片样品由本团队于2024年分别在广西壮族自治区北海市合浦县和福建省大田县发病木薯园内，采集出现异常褪绿、花叶等症状的SLCMD疑似病叶，同时在附近无病薯园内收集无病叶片。烟粉虱（Bemisia tabaci）样品于2024年采集于广西壮族自治区北海市铁山港区发病薯园。木薯无病叶片基因组DNA、木薯普通花叶病毒（Cassava common mosaic virus，CsCMV）cDNA、木薯细菌性萎蔫病菌（cassava bacterial blight，CBB）基因组DNA、SLCMV重组质粒标准品（载体为pMD 18-T vector，克隆有该病毒外壳蛋白AV1编码序列，GenBank登录号为WCR23751）等均由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供。

1.1.2　主要试剂与仪器

Ex Taq酶、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、pMD 18-T Vector、质粒提取试剂盒、实时荧光定量PCR（探针法）试剂盒等分别购自宝生物工程（大连）有限公司和天根生化科技（北京）有限公司；荧光探针、引物由深圳华大基因科技有限公司合成。所用主要仪器为qTower 3G实时荧光定量PCR仪，购自德国椰拿分析仪器有限公司。

1.2　方法

1.2.1　样品总DNA提取

参考王国芬等^[7]和何海芳^[11]的方法，分别提取木薯叶片、单头烟粉虱总DNA，方法略有改进，每0.1 g叶片及每头烟粉虱的DNA样品分别用50 μL和30 μL去离子水进行溶解。

1.2.2　引物与探针设计与合成

参照周司珊^[8]的方法，合成引物对SL12/SL13和CP1F/CP1R（表1）进行样品的巢式PCR检测。基于SLCMV外壳蛋白AV1基因保守序列，设计特异性引物SLCMV-QF638/SLCMV-QR699和探针Probe-661（表1），用于TaqMan qPCR研究。

1.2.3　TaqMan qPCR引物验证

随机选取2份SLCMD阳性样品和2份无病木薯样品DNA（阴性对照），以ddH₂O为空白对照，参照林兆威等^[12]的方法，用SLCMV-QF638/SLCMV-QR699引物对和探针Probe- 661进行TaqMan qPCR。

1.2.4　阳性质粒标准品的制备及灵敏度、特异性与重复性验证

参考林兆威等^[12]的方法进行阳性质粒标准品的制备。以感染斯里兰卡木薯花叶病毒病（SLCMV）的木薯叶片DNA为阳性对照，以木薯无病叶片基因组DNA、木薯普通花叶病毒cDNA、木薯细菌性萎蔫病菌基因组DNA、无菌水等为阴性对照进行特异性试验。以不同浓度梯度的的阳性质粒标准品为模板进行灵敏度和重复性验证。各处理重复3次。

1.2.5　田间样本检测

选取分别来自广西壮族自治区北海市合浦县和福建省大田县发病木薯园的疑似SLCMD样品，以及来自北海市铁山港区的烟粉虱样品，分别进行巢式PCR和TaqMan qPCR检测，并计算其拷贝数区间。

2　结果与分析

收起

2.1　荧光定量PCR引物验证

随机选取2份具有SLCMD典型症状阳性样品和2份无病阴性样品的基因组为模板，以ddH₂O为空白对照，利用引物SLCMV-QF638/SLCMV-QR699和探针Probe-661进行TaqMan qPCR扩增。阴性样品和空白对照未产生扩增产物，呈一条直线，而2份阳性样品的扩增产物浓度均出现指数增长，表现为“S”形扩增曲线。试验结果表明所设计的引物/探针组合能有效检测到SLCMV，可进行进一步研究（图1）。

2.2　灵敏度试验与标准曲线的建立

SLCMV重组质粒提取后，用NanoDrop 2000超微量紫外分光光度计测其质量浓度为38.5 ng/μL，A_260/280比值为1.79，换算成拷贝数为4.5×10¹⁰ copies/μL。以阳性质粒标准品4.5×10⁹~4.5×10⁰ copies/μL等10个浓度梯度为模板，无病木薯样品为阴性对照，用本研究设计的引物对和探针进行TaqMan qPCR。当质粒浓度在4.5×10¹ copies/μL以上时，该反应体系均可检出（图2）。标准曲线表明C_t值与拷贝数的对数呈良好的线性关系，斜率为‒3.1312，相关系数（R²）为0.9969，扩增效率（E）为97.9%，其标准曲线方程为y=−3.1312x+34.599（图3）。

2.3　特异性试验

以无菌水为空白对照（blank control，BC），无病叶片（disease-free leaves，DFL）的基因组DNA、木薯普通花叶病毒cDNA和木薯细菌性萎蔫病菌基因组DNA等为阴性对照进行SLCMV的TaqMan qPCR检测。结果仅SLCMV出现扩增曲线，空白对照、木薯无病叶片的基因组DNA、木薯普通花叶病毒cDNA、木薯细菌性萎蔫病菌基因组DNA等样品均未获得扩增产物（图4），表明该方法对SLCMV的检测效果具有良好的特异性，无病木薯组织及2种常见病害均不会对本检测方法产生非特异性干扰。

2.4　重复性验证

分别制备浓度为4.5×10⁶、4.5×10⁷、4.5×10⁸、4.5×10⁹ copies/μL的阳性质粒标准品，以其为模板进行TaqMan qPCR的组内、组间的重复性和稳定性评价。组内重复性试验结果表明，C_t值的变异系数为0.53%~0.84%。以相同的试验条件，对每个稀释浓度分别进行3次独立的重复性试验，结果表明C_t值的变异系数为0.67%~1.58%。组内变异系数小于1%，而组间变异系数小于2%，表明建立的TaqMan qPCR方法的重复性和稳定性较好（表2）。

2.5　田间样本检测

随机选取分别来自广西合浦和福建大田的病样，利用本试验建立的TaqMan qPCR和巢式PCR技术分别进行检测。巢式PCR检测结果显示，广西合浦田间22份样品中有7份为阳性，而TaqMan qPCR检测出21份阳性。福建大田样品用巢式PCR检测出11份为阳性，而TaqMan qPCR检测出14份阳性。相关结果表明，TaqMan qPCR检出率显著高于巢式PCR技术，这与该方法灵敏度更高一致。计算其最低和最高拷贝数，得出其阳性的病毒拷贝数，合浦地区木薯样品病毒拷贝数在1.43×10⁵~4.09×10¹¹ copies/g之间，而福建大田木薯样品病毒拷贝数在6.70×10⁵~1.88×10⁹ copies/g之间（表3）。

在广西北海铁山港区发病木薯园随机选择14株受害植株，各抓取1头烟粉虱，提取基因组DNA后应用TaqMan qPCR方法对营盘镇田间疑似SLCMV感染的木薯烟粉虱种群进行单头定量检测。结果表明，12头烟粉虱携带有SLCMV，比例为85.71%，其C_t值均低于23.65，而单头烟粉虱携带病毒数量在9.42×10⁴~2.33×10⁹ copies/头之间（表4）。

3　讨论

收起

在植物病毒快速检测方法研发中，灵敏度和特异性是主要考虑的因素。TaqMan qPCR具有很高的灵敏度，可检测低至几个拷贝的病毒核酸，尤其适用于早期感染或低浓度病原物的检测。在甘薯双生病毒^[13]、番茄褪绿病毒^[14]、香蕉线条病毒^[15]和柑橘褪绿矮缩病毒^[16]等的检测中，TaqMan qPCR比常规PCR的灵敏度高100倍，同时对一些难于分离和核酸提取的微量病原物，如槟榔黄化植原体和槟榔隐症病毒1型，具有明显的优势^[12]。在特异性方面，TaqMan qPCR利用上下游引物和中间探针进行双重验证，使其特异性更强，有效避免非特异性扩增，减少了假阳性结果。探针法的优势还在于能对样品进行定量和定性分析，通过标准曲线可精确计算病毒载量，为病害流行学研究提供数据支持。检测过程完全封闭减少交叉污染，且后续无需处理，进一步提高检测工作的效率。

在我国，木薯主要病害的早期侵染症状具有较高的相似性。木薯普通花叶病由木薯普通花叶病毒（属于RNA病毒）侵染引起，受害叶片同样形成和SLCMD相似的“花叶状”^[7]，仅能通过分子检测才能确认。细菌性萎蔫病是我国木薯种植中为害最严重的病害，发病叶片最初同样出现相似的褪绿症状，只有症状充分形成后才能够准确识别。因此，病害的早期诊断，一直是监控工作中的难题。传统的田间识别方法依赖典型症状的识别，往往延误防控时机。此外，田间条件下，常存在多种病原的复合侵染现象，进一步增加了诊断难度。本研究建立的TaqMan qPCR技术针对木薯花叶病毒（SLCMV）的保守序列设计引物和探针，通过优化反应条件（如退火温度、引物浓度等），可实现对木薯组织、烟粉虱等的SLCMV精准检测，且具有良好的特异性。另外，周司珊^[8]发现巢式PCR的灵敏度比常规PCR高100倍。与巢式PCR相比，本研究建立的TaqMan qPCR技术，灵敏度进一步提高了10倍，从而有助于实现病害的早期精准诊断，2种方法的田间检测结果也证明了这一点。此外，本技术还实现了对病毒传播媒介烟粉虱的携毒检测，从而能够有效监测田间带毒介体数量，为该病害的早期预警和综合防控提供技术支持。

4　结论

收起

SLCMD是国际木薯危险性病害，本研究成功建立一种基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR方法，用于检测斯里兰卡木薯花叶病毒（SLCMV）。该方法具有高灵敏度、强特异性和良好的重复性，能够有效检测SLCMV的早期感染。和常规PCR相比，该方法检测效率提高1000倍，也比巢式PCR高10倍。标准曲线显示，C_t值与拷贝数的对数之间呈现良好的线性关系，扩增效率为97.9%，标准曲线方程为y=–3.1312x+34.599。特异性研究表明该方法仅能针对SLCMV进行有效扩增，无病叶片、木薯普通花叶病等病原均不能获得扩增产物。田间应用表明，该方法可有效提高病毒样品的检出率，能够为该病的田间鉴定、早期诊断、无毒种茎评价等监控工作提供有效的技术支持，有望在该病田间监控工作中发挥重要作用。

基金

收起

国家木薯产业技术体系病害防控岗(CARS-11-HNHGX)
热带作物生物育种全国重点实验室热带专项创新团队项目(NKLTCBCXTD32)
国家重点研发计划项目(2020YFD1000600)

参考文献

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文献

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参考文献引证文献

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2025年第46卷第9期

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doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.09.003

接收时间：2025-04-01
首发时间：2026-03-07
出版时间：2025-09-25

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收稿日期：2025-04-01
录用日期：2025-05-22

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国家木薯产业技术体系病害防控岗(CARS-11-HNHGX)

热带作物生物育种全国重点实验室热带专项创新团队项目(NKLTCBCXTD32)

国家重点研发计划项目(2020YFD1000600)

作者信息

^1.黑龙江八一农垦大学农学院，黑龙江大庆　163319

^3.中国热带农业科学院三亚研究院/热带作物生物育种全国重点实验室，海南三亚　572024

通讯作者:

^* 黄贵修（HUANG Guixiu），E-mail：hgxiu@vip.163.com。

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

引物名称 Primer name	序列（5′–3′） Sequence（5′–3′）	扩增产物长度 Length of amplification product/nt	用途 Purpose
SL12	CACGGTTTCCGGTGTATGCT	1058	SLCMV nested PCR detection
SL13	CCTGGCGTTTCTTGAGGGTAT
CP1F	AACTTCGACAGCCCATACAG	287
CP1R	AGGATATAAACGGACTTAACGC
SLCMV-QF638	AGCAAGAGGCTGGCAAGTATGA	62	TaqMan qPCR detection
SLCMV-QR699	ACACGCCATGTACAGCATCAA
Probe-661	AATCATACCGAGAATGC	17

引物名称
Primer name

序列（5′–3′）
Sequence（5′–3′）

扩增产物长度
Length of amplification product/nt

用途
Purpose

SL12

CACGGTTTCCGGTGTATGCT

1058

SLCMV nested PCR detection

SL13

CCTGGCGTTTCTTGAGGGTAT

CP1F

AACTTCGACAGCCCATACAG

287

CP1R

AGGATATAAACGGACTTAACGC

SLCMV-QF638

AGCAAGAGGCTGGCAAGTATGA

TaqMan qPCR detection

SLCMV-QR699

ACACGCCATGTACAGCATCAA

Probe-661

AATCATACCGAGAATGC

标准品拷贝数 Standard copy number/（copies·μL^-1）	组内重复性试验Intra-group repeat test	组间重复性试验Inter-group repeat test
4.5×10⁶	33.72±0.18	0.53	34.18±0.37	1.08
4.5×10⁷	33.41±0.28	0.84	32.62±0.52	1.58
4.5×10⁸	30.79±0.25	0.81	30.55±0.34	1.11
4.5×10⁹	28.42±0.22	0.77	28.28±0.19	0.67

标准品拷贝数
Standard copy number/（copies·μL^-1）

组内重复性试验Intra-group repeat test

组间重复性试验Inter-group repeat test

平均值±标准差
Mean±SD

变异系数
Coefficient of variation/%

平均值±标准差
Mean±SD

变异系数
Coefficient of variation/%

4.5×10⁶

33.72±0.18

0.53

34.18±0.37

1.08

4.5×10⁷

33.41±0.28

0.84

32.62±0.52

1.58

4.5×10⁸

30.79±0.25

0.81

30.55±0.34

1.11

4.5×10⁹

28.42±0.22

0.77

28.28±0.19

0.67

样品编号 Sample No.	品种/种质 Variety/Germplasm	来源 Origin	巢式 PCR Nested PCR	TaqMan qPCR	拷贝数 Copy number/copies·g^-1
HP24101	桂热13	广西合浦	–	+	1.16×10⁶
HP24102	6068		–	+	9.04×10⁵
HP24103	NZ199		–	+	6.45×10⁵
HP24104	沙田面包		–	+	7.40×10⁵
HP24105	SC205		–	+	6.10×10⁵
HP24106	实生5号		+	+	2.00×10⁸
HP24107	实生1号		+	+	2.15×10⁶
HP24108	V04-19		–	+	6.55×10⁵
HP24109	华南9		–	+	1.53×10⁶
HP24110	桂热10		–	+	2.22×10⁷
HP24111	YB201		–	+	7.10×10⁷
HP24112	A09-24		–	+	5.00×10⁸
HP24113	RXC09		–	–	0
HP24114	V06-31		–	+	1.06×10⁶
HP24115	面包木薯		–	+	1.43×10⁵
HP24116	杂NK-10		+	+	4.09×10¹¹
HP24117	NK-10-8		+	+	4.19×10⁸
HP24118	实生5号		+	+	1.35×10⁸
HP24119	NK-10-1		+	+	3.98×10¹¹
HP2420	YB201		+	+	7.25×10⁷
HP2421	TCGRI028		–	+	1.56×10⁷
HP2422	桂11		–	+	1.96×10⁶
DT2401	F499	福建大田	+	+	1.78×10⁶
DT2402	GR911		–	+	6.70×10⁵
DT2403	沙田		–	–	0
DT2404	A05-138		–	+	2.57×10⁸
DT2405	C		+	+	3.11×10⁶
DT2406	YB69		+	+	1.14×10⁸
DT2407	NZ199		+	+	5.04×10⁸
DT2408	V4-8		+	+	1.32×10⁷
DT2409	49		+	+	3.04×10⁸
DT2410	NZ199		+	+	7.00×10⁸
DT2411	V4-8		+	+	1.88×10⁹
DT2412	49		+	+	1.01×10⁶
DT2413	NZ199		+	+	3.37×10⁸
DT2414	A		+	+	3.69×10⁸

样品编号
Sample No.

品种/种质
Variety/Germplasm

来源
Origin

巢式
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TaqMan qPCR

拷贝数
Copy number/copies·g^-1

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桂热13

广西合浦

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–

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NZ199

–

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HP24104

沙田面包

–

7.40×10⁵

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SC205

–

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HP24106

实生5号

2.00×10⁸

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2.15×10⁶

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6.55×10⁵

HP24109

华南9

–

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桂热10

–

2.22×10⁷

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–

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HP24113

RXC09

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1.96×10⁶

DT2401

F499

福建大田

1.78×10⁶

DT2402

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–

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DT2403

沙田

–

DT2404

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DT2406

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DT2407

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DT2408

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DT2409

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DT2410

NZ199

7.00×10⁸

DT2411

V4-8

1.88×10⁹

DT2412

1.01×10⁶

DT2413

NZ199

3.37×10⁸

DT2414

3.69×10⁸

样品编号 Sample No.	拷贝数 Copy number	样品编号 Sample No.	拷贝数 Copy number
Bt241201	3.03×10⁵	Bt241208	0
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Bt241207	2.898×10⁵	Bt241214	6.285×10⁵

样品编号
Sample No.

拷贝数
Copy number

样品编号
Sample No.

拷贝数
Copy number

Bt241201

3.03×10⁵

Bt241208

Bt241202

2.34×10⁶

Bt241209

3.48×10⁶

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Bt241205

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1.641×10⁹

Bt241206

5.79×10⁵

Bt241213

1.545×10⁹

Bt241207

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Bt241214

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