热带作物学报

菌株Strain	培养基Medium	抑菌圈直径Antibacterial circle diameter/mm
HZ037	LM1	-	-	-	-	-	12	-	10	-
	LM3	-	-	-	-	-	11	-	10	-
HZ041	LM1	-	15	-	-	-	-	-	-	13
	LM3	-	14	-	-	-	-	-	-	14
HZ046	LM1	-	-	-	-	-	-	-	12	14
	LM3	-	-	-	-	-	-	-	12	13
HZ051	LM1	14	16	-	-	-	-	-	-	-
	LM3	15	16	-	-	-	-	-	-	-
HZ054	LM1	-	-	-	-	9	-	13	-	-
	LM3	-	-	-	-	9	-	13	-	-
HZ055	LM1	-	-	-	13	-	-	-	14	-
	LM3	-	-	-	12	-	-	-	14	-
HZ056	LM1	-	-	-	-	-	-	15	-	-
	LM3	-	-	-	-	-	-	15	-	-
HZ057	LM1	-	-	-	-	13	-	11	-	-
	LM3	-	-	-	-	12	-	10	-	-
HZ063	LM1	-	-	-	-	-	-	-	12	-
	LM3	-	-	-	-	-	-	-	12	-

菌株Strain	培养基Medium	抑菌圈直径Antibacterial circle diameter/mm
HZ037	LM1	-	-	-	-	-	12	-	10	-
	LM3	-	-	-	-	-	11	-	10	-
HZ041	LM1	-	15	-	-	-	-	-	-	13
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HZ046	LM1	-	-	-	-	-	-	-	12	14
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HZ051	LM1	14	16	-	-	-	-	-	-	-
	LM3	15	16	-	-	-	-	-	-	-
HZ054	LM1	-	-	-	-	9	-	13	-	-
	LM3	-	-	-	-	9	-	13	-	-
HZ055	LM1	-	-	-	13	-	-	-	14	-
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HZ057	LM1	-	-	-	-	13	-	11	-	-
	LM3	-	-	-	-	12	-	10	-	-
HZ063	LM1	-	-	-	-	-	-	-	12	-
	LM3	-	-	-	-	-	-	-	12	-

模式菌Model bacteria	ANI/%	dDDH/%
S. djakartensis JCM 4957^T	94.27	56.00
S. swartbergensis HMC13^T	89.81	39.10
S. venetus JCM 31290^T	90.29	40.30
S. afghaniensis 772^T	89.81	39.10
S. africanus NRRLB-24243^T	89.59	38.60
S. azureuss ATCC 14921^T	89.68	38.40
S. caelestis DSM 40084^T	89.45	38.10
S. tuirus JCM 4255^T	88.87	36.00
S. massasporeus JCM 4139^T	88.73	36.20
S. hawaiiensis ATCC 12236^T	89.81	39.10
S. levis JCM 6924^T=NBRC 15423^T	88.38	35.50

模式菌Model bacteria	ANI/%	dDDH/%
S. djakartensis JCM 4957^T	94.27	56.00
S. swartbergensis HMC13^T	89.81	39.10
S. venetus JCM 31290^T	90.29	40.30
S. afghaniensis 772^T	89.81	39.10
S. africanus NRRLB-24243^T	89.59	38.60
S. azureuss ATCC 14921^T	89.68	38.40
S. caelestis DSM 40084^T	89.45	38.10
S. tuirus JCM 4255^T	88.87	36.00
S. massasporeus JCM 4139^T	88.73	36.20
S. hawaiiensis ATCC 12236^T	89.81	39.10
S. levis JCM 6924^T=NBRC 15423^T	88.38	35.50

序号No.	类型Type	已知最相似的集群The most similar cluster	相似度Similarity/%	参考文献Reference
1	NRPS-like
2	terpene	hopene	92	[16]
3	hydrogen-cyanide	aborycin	21	[17]
4	NI-siderophore	kinamycin	19	[18]
5	ectoine	ectoine	100	[19]
6	RiPP-like
7	terpene	geosmin	100	[20]
8	T1PKS, butyrolactone	4-hexadecanoyl-3-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-2H-furan-5-one	45
9	NI-siderophore	desferrioxamin B/desferrioxamine E	100	[21]
10	T1PKS, melanin	melanin	80	[22]
11	terpene	SCO-2138	14
12	T1PKS, butyrolactone	Thaxtomin D/thaxtomin A/thaxto-min C/thaxtomin B	16	[23]
13	NI-siderophore	paulomycin	11	[24]
14	RiPP-like, lanthipeptide-class-iii	informatipeptin	100
15	amglyccycl	spectinomycin	54	[25]
16	oligosaccharide, LAP, RRE-containing
17	terpene	albaflavenone		[25]
18	NRP-metallophore, NRPS	coelichelin	100	[25]
19	other	colibrimycin
20	butyrolactone, NRPS	cyclofaulknamycin		[26]
21	phenazine	phenazineSA/phenazine SB/phenazi-ne SC	37	[27]
22	triceptide
23	RiPP-like	granaticin	5	[28]
24	terpene	isorenieratene	100	[29]
25	butyrolactone	cyphomycin	5	[30]
26	melanin	melanin	42	[21]
27	T1PKS, NRPS
28	T2PKS	spore pigment	75	[31]
29	T3PKS	germicidin	100	[32]

序号No.	类型Type	已知最相似的集群The most similar cluster	相似度Similarity/%	参考文献Reference
1	NRPS-like
2	terpene	hopene	92	[16]
3	hydrogen-cyanide	aborycin	21	[17]
4	NI-siderophore	kinamycin	19	[18]
5	ectoine	ectoine	100	[19]
6	RiPP-like
7	terpene	geosmin	100	[20]
8	T1PKS, butyrolactone	4-hexadecanoyl-3-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-2H-furan-5-one	45
9	NI-siderophore	desferrioxamin B/desferrioxamine E	100	[21]
10	T1PKS, melanin	melanin	80	[22]
11	terpene	SCO-2138	14
12	T1PKS, butyrolactone	Thaxtomin D/thaxtomin A/thaxto-min C/thaxtomin B	16	[23]
13	NI-siderophore	paulomycin	11	[24]
14	RiPP-like, lanthipeptide-class-iii	informatipeptin	100
15	amglyccycl	spectinomycin	54	[25]
16	oligosaccharide, LAP, RRE-containing
17	terpene	albaflavenone		[25]
18	NRP-metallophore, NRPS	coelichelin	100	[25]
19	other	colibrimycin
20	butyrolactone, NRPS	cyclofaulknamycin		[26]
21	phenazine	phenazineSA/phenazine SB/phenazi-ne SC	37	[27]
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23	RiPP-like	granaticin	5	[28]
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25	butyrolactone	cyphomycin	5	[30]
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28	T2PKS	spore pigment	75	[31]
29	T3PKS	germicidin	100	[32]

菌株Strain	菌株生长情况Growth status of strains
HZ037	+++	+++	+++	++	+	-	-	-
HZ041	+++	+++	+++	++	+	-	-	-
HZ046	+++	+++	+++	++	+	-	-	-
HZ051	+++	+++	+++	++	+	-	-	-
HZ053	+++	+++	+++	++	+	-	-	-
HZ054	+++	+++	+++	++	+	+	+	-
HZ057	+++	+++	+++	++	+	+	+	-
HZ055	+++	+++	+++	++	+	-	-	-
HZ063	+++	+++	+++	++	+	-	-	-

菌株Strain	菌株生长情况Growth status of strains
HZ037	+++	+++	+++	++	+	-	-	-
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HZ063	+++	+++	+++	++	+	-	-	-

南海羽毛藻共附生放线菌分离鉴定及其活性测定

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刘哲良 ¹^,²^,³ , 郭志凯 ² , 阿布来孜艾丽曼· ² , 张世清 ² , 马帅 ² , 王蓉 ³^,^* , 熊子君 ²^,^*

热带作物学报 | 植物保护与生物安全 2025,46(6): 1522-1532

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热带作物学报 |植物保护与生物安全 2025 , 46 (6) : 1522 -1532

南海羽毛藻共附生放线菌分离鉴定及其活性测定

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刘哲良¹^,²^,³, 郭志凯², 阿布来孜艾丽曼·², 张世清², 马帅², 王蓉³^,^*, 熊子君²^,^*

作者信息

^1.海南热带海洋学院，海南三亚　572000

^2.中国热带农业科学院热带生物技术研究所/海南省热带微生物资源重点实验室/海南热带农业资源研究院/海南省热带农业生物资源保护与利用重点实验室，海南海口　571101

^3.海南省海洋与渔业科学院/海南省热带海水养殖技术重点实验室，海南海口　571126

通讯作者:

^* 王蓉（WANG Rong），E-mail：wangrong1982@gmail.com

熊子君（XIONG Zijun），E-mail：xiongzijun@itbb.org.cn。

Isolation, Identification and Antibacterial Activity of Symbiotic or Epiphytic Actinomycetes Associated with Caulerpa sertularoides f. Longipes in South China Sea

Zheliang LIU¹^,²^,³, Zhikai GUO², Ailiman A BU LAI ZI², Shiqing ZHANG², Shuai MA², Rong WANG³^,^*, Zijun XIONG²^,^*

Affiliations

^1.Hainan Tropical Ocean University, Sanya, Hainan 572000, China

^2.Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Hainan Key Laboratory of Tropical Microbe Resources / Hainan Institute for Tropical Agricultural Resources / Key Laboratory for Biology and Genetic Resources of Tropical Crops of Hainan Province, Haikou, Hainan 571101, China

^3.Hainan Academy of Ocean and Fisheries Sciences / Hainan Provincial Key Laboratory of Tropical Maricultural Technologies, Haikou, Hainan 571126, China

出版时间: 2025-06-25 doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.06.024

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摘要

收起

病原细菌是造成水产养殖业损失的主要因素，目前生物防治被认为是一种很有前途的防治策略。海藻是海洋生态系统的重要组成部分，海藻藻际有丰富多样的微生物群落。为探究南海海藻共附生放线菌资源的多样性及潜在的应用价值，对海南陵水羽毛藻共附生放线菌进行分离、鉴定与抗菌活性测试。采用稀释涂布法对采集的羽毛藻进行放线菌分离，并进行16S rRNA基因测序、序列比对及系统发育树构建。结果表明：分离获得链霉菌属（Streptomyces）20株、拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）1株以及微杆菌属（Microbacterium）1株；采用滤纸片法以欧文斯氏弧菌（Vibrio owensii）等9种病原细菌为靶标对菌株发酵粗提物进行抗菌活性测试，结果显示，所有菌株至少对1种细菌表现出抑制作用；通过高效液相色谱分析菌株粗提物的化学多样性，结果显示，菌株HZ057具有更丰度的次级代谢产物；为了进一步研究菌株盐胁迫耐性，进行了耐盐性测试，结果显示，所有菌株在0%~4% NaCl条件下生长良好，菌株HZ054和HZ057在12% NaCl浓度下仍有孢子生长；对菌株HZ057进行全基因组测序并通过antiSMASH预测各基因簇功能，结果显示，其基因组含有29个次级代谢产物基因簇且结构类型多样，有待进一步深入发掘。本研究从南海羽毛藻中分离获得链霉菌属、拟诺卡氏菌属以及微杆菌属菌株，并且发现它们具有一定程度的抗菌活性和较丰富的次级代谢产物产生能力，具有潜在的研究价值。本研究结果为推进羽毛藻共附生微生物的开发利用，以及为南海海藻共附生放线菌资源的研究奠定基础。

关键词

羽毛藻 / 共附生放线菌 / 分离鉴定 / 抗菌活性 / 次级代谢产物

Abstract

收起

Pathogenic bacteria are the primary causative agents of economic losses in the aquaculture industry, and biological control is currently regarded as a promising strategy for prevention and management. Algae, as crucial components of marine ecosystems, host diverse and abundant microbial communities within their phycospheres. In order to explore the diversity and potential application value of algae-associated symbiotic or epiphytic actinomycetes resources in South China Sea, the isolation identification and antibacterial activity screening of symbiotic or epiphytic actinomycetes from Caulerpa sertularoides f. Longipes, collected from Lingshui, Hainan, were carried out. Actinomycetes were isolated through dilution coating method and identified according to the 16S rRNA gene sequences alignment and by phylogenetic tree construction. The results revealed that 20 strains were identified as Streptomyces, one as Nocardiopsis, and one as Microbacterium. The antibacterial activity of the fermented crude extracts of the obtained strains was evaluated against nine pathogenic bacteria, including Vibrio owensii using the filter paper method. Results showed that all strains exhibited inhibitory effects on at least one type of bacteria. High-performance liquid chromatography (HPLC) was employed to assess the chemical diversity of the crude extracts. Results showed that strain HZ057 had a higher abundance of secondary metabolites than other strains. To further investigate the salt stress tolerance of the strains, salt tolerance tests were conducted. The results showed that all the strains could grow well on 0%-4% NaCl, HZ054 and HZ057 could still grow at a salt concentration of 12%. The whole genome of HZ057 was sequenced and the functions of each gene cluster were predicted using antiSMASH. The analysis revealed that the genome contained 29 secondary metabolite genes clusters with diverse structural types, indicating that this strain is associated with a rich diversity of secondary metabolites. In this study, strains of Streptomyces, Nocardiopsis and Micrococcus were isolated firstly from the algae Caulerpa sertularoides f. Longipes in the South China Sea, indicating that the algae contained abundant actinomycete resources. Moreover, it was found that the identified strains exhibited significant antibacterial activity and the ability to produce a variety of secondary metabolites, suggesting the potentials for future research and applications.

Key words

Caulerpa sertularoides f. Longipes / symbiotic or epiphytic actinomycetes / isolation and identification / antibacterial activity / secondary metabolites

引用本文

刘哲良, 郭志凯, 阿布来孜艾丽曼·, 张世清, 马帅, 王蓉, 熊子君. 南海羽毛藻共附生放线菌分离鉴定及其活性测定. 热带作物学报, 2025 , 46 (6) : 1522 -1532 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.06.024

Zheliang LIU, Zhikai GUO, Ailiman A BU LAI ZI, Shiqing ZHANG, Shuai MA, Rong WANG, Zijun XIONG. Isolation, Identification and Antibacterial Activity of Symbiotic or Epiphytic Actinomycetes Associated with Caulerpa sertularoides f. Longipes in South China Sea[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2025 , 46 (6) : 1522 -1532 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.06.024

正文

收起

在过去几十年，自然渔业资源的枯竭促进了水产养殖的蓬勃发展，目前亚洲水产60%以上来源于中国，并且产量还在逐年增加。大规模及高密度养殖使海洋病原细菌引起的病害严重影响水产养殖业^[1-2]。据不完全统计，水产病害导致我国每年水产养殖损失高达上百亿元。为快速有效地控制各种疾病，人们常使用杀菌剂及抗生素等化学药物，但滥用化学药剂导致耐药性等问题日益突出，促使对生物防治的需求不断提高。目前放线菌来源的天然产物已成为微生物源农药的主体之一^[3]。如土霉素和克林霉素已广泛应用于渔业病害防治，以减缓或替代部分化学农药的使用。由于陆生环境中新生物活性物质的发现数量逐年减少，导致人类对新型生物活性物质的探索进程受到严重阻碍^[4]，人类将目光转向目前开发不足10%的海洋。海洋放线菌在高压、高盐、缺氧、低（无）光照等特殊的海洋生态系统中可能产生结构新颖和活性显著的次级代谢产物^[5-8]。

海藻藻际存在大量微生物，海藻为微生物提供营养，反之微生物通过产生生物活性物质或结构新颖的次级代谢产物保护其宿主^[9-10]。例如，石莼来源放线菌产生具有抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）活性的苯丙霉素类化合物^[11]，从褐藻中分离得到的链霉菌产生活性代谢物去铁胺B及其新衍生物去铁胺B2对MRSA、耐亚胺培南鲍氏不动杆菌（imipenem-resistant Acinetobacter baumannii，IRAB）和耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌（carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa，CRPA）具有抗菌活性^[12]。由此可见，海藻共附生放线菌具有产生新的活性次级代谢产物的能力，但是目前对藻类共附生微生物的研究主要集中在真菌上，而对放线菌培养利用的研究较少^[13]。

羽毛藻，学名棒叶蕨藻变种（Caulerpa sertularoides f. Longipes），隶属于绿藻门（Chlorophyta）绿藻纲（Chlorophyceae）蕨藻目（Caulerpales）蕨藻科（Caulerpaceae）蕨藻属（Caulerpa），是一种羽毛状的海藻，具有繁殖快、生长快和环境适应性强、吸收污染物以及生产有机物和氧气等特点。近年来LIMA等^[14]研究发现，将羽毛藻与虾共生能使虾的存活率与生长率显著提高，这可能与羽毛藻表面的微生物有关，但尚未进行验证。本研究对羽毛藻样品的共附生放线菌进行分离、鉴定，并对其抗菌活性和次级代谢产物多样性进行评价，以推进羽毛藻共附生微生物的开发利用，为南海海藻共附生放线菌资源研究奠定基础。

1　材料与方法

收起

1.1　材料

1.1.1　供试样品

羽毛藻样品采自海南省陵水黎族自治县黎安镇黎安港泻湖（110°03′3.00″E，18°25′46.66″N），采后将样品装入无菌密封袋中置于冰盒中保存。

1.1.2　培养基

（1）分离培养基。改良高氏1号培养基^[10]：可溶性淀粉20.0 g/L、氯化钠0.5 g/L、硫酸亚铁0.01 g/L、硝酸钾1.0 g/L、磷酸氢二钾0.5 g/L、硫酸镁0.5 g/L、琼脂15.0 g/L、海盐17.5 g/L，pH为7.3±0.2。

TWYE培养基^[15]：酵母提取物0.25 g/L、磷酸氢二钾0.5 g/L、琼脂20 g/L、海盐17.5 g/L，pH为7.3±0.2。

1/2 ATCC培养基^[10]：葡萄糖10.0 g/L、可溶性淀粉20.0 g/L、酵母提取物5.0 g/L、酸水解酪蛋白5.0 g/L、碳酸钙1.0 g/L、琼脂15.0 g/L、海盐17.5 g/L，pH为7.3±0.2。

（2）放线菌纯化培养基。ISP2培养基^[10]：麦芽提取物10.0 g/L、酵母提取物4.0 g/L、葡萄糖4.0 g/L、琼脂20.0 g/L、海盐17.5 g/L，pH为7.3±0.2。

（3）放线菌液体发酵培养基。LM1培养基：蔗糖20.0 g/L、麦芽提取物10.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L、蛋白胨1.0 g/L、碳酸钙1.0 g/L、海盐17.5 g/L，pH为7.3±0.2。

LM3培养基：葡萄糖20.0 g/L、麦芽提取物10.0 g/L、蛋白胨1.0 g/L、碳酸钙1.0 g/L、海盐17.5 g/L，pH为7.3±0.2。

（4）抗菌活性筛选培养基。LB液体培养基^[15]：胰蛋白胨10.0 g/L、酵母粉5.0 g/L、氯化钠5.0 g/L、琼脂20.0 g/L，pH为7.3±0.2。

胰酪大豆胨液体培养基（TSB）^[10]：胰酪胨17.0 g/L、大豆木瓜蛋白酶水解物3.0 g/L、氯化钠5.0 g/L、磷酸氢二钾2.5 g/L、葡萄糖2.5 g/L、海盐17.5 g/L，pH为7.3±0.2。

1.1.3　供试病原菌菌株

水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. Oryzae，A）、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae，B）、哈维氏弧菌（Vibrio harveyi，C）、溶藻弧菌（V. alginolyticus，D）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus，E）、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA，F）、欧文斯氏弧菌（V. owensii，G）、海豚链球菌（S. iniae，H）、美人鱼发光杆菌（Photobacterium damselae，I）保存于中国热带农业科学院热带生物技术研究所。

1.1.4　主要试剂和仪器

电子分析天平ME104T购自瑞士Mettler Toledo集团；恒温摇床（ZQZYCS8V）购自上海知楚仪器有限公司；色谱甲醇购自天津康科德科技有限公司；分析纯级乙酸乙酯购自广东光华科技股份有限公司；二甲基亚砜（DMSO）购自上海麦克林生化科技有限公司；电热鼓风干燥箱购自上海一恒科学仪器有限公司；生化培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司；立式旋转蒸发仪购自上海爱朗仪器有限公司；高效液相色谱仪（1260型）购自美国Agilent公司；数控超声波清洁器KQ-500DE购自东莞市科桥超声波设备有限公司。

1.2　方法

1.2.1　样品处理及其共生微生物分离纯化

使用无菌半海水（海盐浓度为1.75%）清洗羽毛藻样品2~3次，将沙泥冲洗干净，用75%酒精浸泡30 s杀灭表面细菌，然后用无菌半海水冲洗2遍，置于超净台晾干。使用无菌镊子、剪刀将样品剪成小块，置于无菌研钵中，加入5~10 mL无菌半海水研磨成浆，移入无菌试管进行梯度稀释，吸取原液、10^-1、10^-2、10^-3稀释液各200 μL涂布于高氏1号、TWYE以及1/2 ATCC培养基（分离培养基均含50 μg/mL重铬酸钾）上，重复2个平板。倒置于28 ℃恒温培养箱中培养，每周观察，培养至8周。根据菌落形态用牙签挑取分离板上的单菌落，接种至ISP2固体平板培养基进行纯化培养，多次纯化后得到纯培养物，对菌株进行编号，将菌株保存于无菌甘油（20%）中，置于–80 ℃保存，备用。

1.2.2　放线菌16S rRNA基因序列分析

将分离得到的菌株进行16S rRNA基因测序。将获得的序列在EZ BioCloud（https://www.ezbiocloud.net/login）数据库中进行同源序列比对搜索，选择相似度大于98%的菌株的16S rRNA基因序列作为参比对象，使用MEGA 11软件进行多序列对比，采用邻接法（neighbor-joining method）进行系统发育树的构建和分析。

1.2.3　菌株的抗菌活性筛选

以供试病原菌菌株为指示菌进行活性筛选。在50 mL锥形瓶中配制20 mL液体LB培养基，于121 ℃高压灭菌20 min，冷却后加入活化的病原菌菌液20 μL，在37 ℃、160 r/min条件下振荡培养12~24 h，使OD₆₀₀为0.50~0.65，用于活性筛选试验，并与40%甘油1∶1混合后保存于–80 ℃。

（1）菌株发酵。根据形态和16S rRNA序列分析结果将分离获得的放线菌去重后选取LM1和LM3液体培养基进行小规模发酵。在纯化的待测放线菌中挑取适量孢子接种于100 mL种子培养基TSB中，在28 ℃、160 r/min条件下振荡培养3 d，然后按体积分数为10%的接种量转接至2 L发酵培养基LM1和LM3中，在28 ℃、160 r/min条件下振荡培养14 d。发酵结束后，在发酵液中加入等体积乙酸乙酯萃取3次，将有机相合并后在旋转蒸发仪中浓缩得到粗提物，粗提物用二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）配制成浓度为20 mg/mL的溶液，置于4 ℃保存，用于抗菌活性检测。

（2）活性筛选。采用滤纸片法观察测定发酵粗提物对9种供试病原菌的抑菌活性。吸取200 μL病原菌菌液和20 mL冷却至50 ℃的LB固体培养基于50 mL锥形瓶中，混匀后倾注于培养皿。待平板凝固后，用无菌镊子放入灭菌滤纸片（直径10 mm），以DMSO为阴性对照，卡那霉素（10 mg/mL）为阳性对照，每个滤纸片上滴加10 μL菌株发酵粗提物（20 mg/mL），设置3次重复，置于28 ℃恒温培养12~24 h后观察。如果供试样品具有抑菌活性，在滤纸片周围会出现清晰的无菌生长抑菌圈。采用十字交叉法测定抑菌圈直径，重复3次。

（3）HPLC分析检测。将菌株HZ037、HZ041、HZ046、HZ051、HZ054、HZ055、HZ056、HZ057、HZ063发酵提取物经色谱甲醇溶解后，使用0.22 μm过滤器过滤，滤液置于质谱小瓶进行HPLC检测（Agilent Zorbox SB C18色谱柱，250 mm×4.6 mm，5μm）。检测条件：以超纯水（A）、甲醇（B）为流动相；梯度洗脱：0~15 min，10%~100% B；15~20min，100% B；20~25 min，10% B，流量为1.0 mL/min，柱温为25 ℃，进样量为10 μL。

1.2.4　菌株的耐盐度试验

刮取分离纯化的9株放线菌孢子接种于TSB液体培养基中，置于摇床于28 ℃、160 r/min振荡培养3 d，吸取200 μL定量涂板。在分离菌株能够生长良好的ISP 2培养基中分别添加0%、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14% NaCl灭菌后倒平板，定量涂布，每组设2个重复，倒置于28 ℃培养箱恒温培养14 d，观察并记录生长情况。

1.2.5　目标菌株的全基因组测序与分析

将菌株纯化后送至测序公司，基于Nanopore promethION 48三代技术平台以及illumina Novaseq 6000二代测序技术平台进行测序，使用Flye软件进行组装得到高质量的组装基因组，通过基因预测、功能元件分析，以及专有数据库注释了解全基因组的信息，通过antiSMASH（https://antismash.secondarymetabolites.org）在线网站对次级代谢基因簇进行分析。

2　结果与分析

收起

2.1　海藻共附生放线菌菌种分离、鉴定

利用3种分离培养基从海南陵水采集的羽毛藻中共分离得到22株放线菌。其中，改良高氏1号培养基分离得到10株，1/2 ATCC培养基分离得到5株，TWYE培养基分离得到7株。由此可见，改良高氏1号培养基用于分离羽毛藻放线菌具有明显优势，可作为首选培养基。为确定菌株分类地位，对22株放线菌进行16S rRNA基因序列鉴定，通过EZ BioCloud序列比对、相似性分析，其中链霉菌属（Streptomyces）最多（20株），拟诺卡氏菌属（Nocardiopsis）和微杆菌属（Microbacterium）各1株，这些菌株为首次从羽毛藻中分离获得的纯培养物。根据16S rRNA基因序列构建22株海藻共附生放线菌相近种之间的系统发育树（图1）。菌株HZ037、HZ039、HZ047、HZ052、HZ053、HZ061和HZ064与S. rochei NRRLB 2410^T的相似度达100%；HZ041、HZ042、HZ043、HZ044、HZ060和HZ062与S. daghestanicus NRRLB 5418^T的相似度为99.93%；HZ046、HZ048和HZ059与S. griseoincarnatus LMG 19316^T的相似度为100%；HZ051与S. abyssomicinicus CHI39^T的相似度为99.85%；HZ054与S. griseoflavus LMG 19344^T的相似度为100%；HZ055与N. changdeensis Mg02^T的相似度为99.71%；HZ056与S. luozhongensis TRM 49605^T的相似度为99.78%；HZ057与S. levis NBRC 15423^T的相似度为99.93%；HZ063与M. resistens NBRC 103078^T的相似度为98.31%。

2.2　菌株发酵粗提物抑菌活性及化学多样性分析

以欧文斯氏弧菌等9种病原细菌为指示菌，采用滤纸片法对9株放线菌发酵粗提物进行抗菌活性测定。抗菌试验结果如表1所示，9株放线菌均对至少1种指示菌表现出抑菌活性，但均对哈维氏弧菌（C）无抑制活性。将菌株HZ037、HZ041、HZ046、HZ051、HZ054、HZ055、HZ056、HZ057以及HZ063的发酵粗提物进行HPLC分析，结果发现菌株HZ057的次级代谢产物相较其他菌株的次级代谢产物丰富度高，以菌株HZ057为研究对象进行后续试验。由于选用的2种液体培养基成分高度相似，使同种菌株在2种不同发酵培养基中获得的粗提物活性和代谢产物丰富度较一致。

2.3　菌株HZ057的全基因组测序与分析

通过高通量测序对菌株HZ057进行全基因组测序获得基因组数据，在NCBI中下载与菌株HZ057邻近的相关菌株基因组序列，利用Type Strain Genome Server（https://tygs.dsmz.de/）构建菌株HZ057与邻近菌株在全基因组水平上的系统发育树（图2）。在基因组系统发育树中，菌株HZ057与S. djakartensis JCM4957^T聚为一支，进化关系最近，通过计算二者的平均核苷酸同一性（average nucleotide identity，ANI）和数字DNA-DNA杂交（digital DNA-DNA hybridization，dDDH），分别为94.27%和56.00%，不支持二者为同一物种；选取与这2株菌聚类为同一大支的另外11株典型菌株，分别计算这些菌株与HZ057的ANI和dDDH（表2），结果显示，ANI均小于目前原核生物分类体系中种分类的ANI临界值（95%）和dDDH临界值（70%）。由此推测，菌株HZ057可能是链霉菌属的一个新物种，但仍需进一步结合其形态学特征、生理生化特征、培养特征和化学特征进行判断。

通过antiSMASH在线网站（https://antismash.secondarymetabolites.org）对菌株HZ057的次级代谢产物生物合成基因簇类型进行分析，结果如表3所示。菌株HZ057存在29个潜在的次级代谢产物合成基因簇，负责合成的次级代谢产物主要类型有：萜类（terpene）、聚酮类（PKS）、类似核糖体肽（RiPP-like）以及铁载体（NI-siderophore）等。从基因簇相似度来看，HZ057有7个基因簇与已知基因簇的相似度为100%；有3个基因簇与已知基因簇的相似度大于60%，有12个基因簇与已知基因簇的相似度小于60%，有7个未知基因簇可能产生新的次级代谢产物。其中，基因簇9位于基因组的4553~76 325 nt，与去铁胺B/E（desferrioxamin B/E）生物合成基因簇相似度达到100%。去铁胺是一种天然的螯合剂，主要用于治疗铁中毒以及与铁相关的疾病治疗^[21]。基因簇24位于基因组46 157~71 976 nt，与萜类化合物isorenierantene生物合成基因簇的相似度为100%。isorenierantene是一种芳香类胡萝卜素，已成为涂抹奶酪的成分之一，具有特殊的抗氧化能力和显著的光保护作用^[29]。基因簇29位于基因组5070~46 254 nt，与Ⅲ型PKS germicidin生物合成基因簇的相似度为100%，germicidin属于α-吡喃酮家族的一员，具有烯烃和芳香化合物的性质，可作为关键的生物合成中间体并参与如生物防御等许多不同类型的生物反应过程，具有广泛的生物活性^[32]。

2.4　菌株耐盐性试验

选择去重后的9株放线菌分别定量涂布于含不同浓度NaCl的ISP2固体培养基（不含海盐）上，培养14 d后观察菌株生长状态。结果表明，所有菌株在含0%~4% NaCl的固体培养基上生长良好，在含6% NaCl的固体培养基上生长一般，在含8% NaCl的固体培养基上有零星孢子生长；菌株HZ054和HZ057在含10%、12% NaCl的固体培养基上仍有孢子生长（表4）。由此可见，菌株HZ054和HZ057具有高度的盐环境适应性。

3　讨论

收起

3.1　海藻的生态与资源价值

海藻不仅对海洋生态系统的健康和平衡发挥着重要作用，而且含有丰富的活性物质。近年来，随着对海洋动植物共附生放线菌的研究不断深入，海藻共附生放线菌被不断发现并受到关注。例如，于伟伟等^[10]采用稀释涂布平板法对6种海藻进行放线菌分离，从西沙海藻共附生环境中分离出盐孢菌属；PALMER等^[32]分离鉴定了褐藻和马尾藻来源的4个放线菌以及绿藻来源的3个放线菌；孙晓梦^[33]利用稀释平板法从采自北极新奥尔松地区的海洋红藻多管藻样品中分离纯化得到60株可培养的藻类附生细菌，其中10株隶属于放线菌门的盐地杆菌属（Salinibacterium）。目前海洋大型藻类已成为获得新型藻类附生菌资源以及新型微生物活性物质的理想研究对象及分离源。

本研究通过采用3种分离培养基对羽毛藻的共附生放线菌进行分离，得到22株放线菌，其中链霉菌属为优势菌属，拟诺卡菌属以及微杆菌属为海洋稀有放线菌属，这表明羽毛藻中的放线菌种类较丰富。在耐盐性测试中所有菌株在含0%~4% NaCl的培养基中均生长良好，而菌株HZ057和HZ054在含12% NaCl的培养基中仍有孢子生长，说明羽毛藻共附生放线菌具有对盐环境的适应性。

3.2　海藻放线菌在水产养殖病害防治中的潜力

由弧菌和链球菌等引起的病害是水产养殖业中影响严重的细菌型病害，发生如体色变黑、鳃丝呈灰白色、腹部肿胀、鳍基部充血、口部充血发红等症状的弧菌病在我国沿海养殖区扩散^[34]；能感染多种经济鱼的无乳链球菌造成鱼的死亡率达30%~80%，经济损失高达数亿元^[35]。海洋病原细菌的抗生素耐药性问题已成为从海洋环境中寻找新型抗菌化合物的重要驱动力。例如，ULFAH等^[36]从红海藻中分离出10种海洋放线菌并进行抗弧菌试验，结果表明，5株放线菌对溶藻弧菌和副溶血性弧菌的最小抑菌浓度（MIC）在0.625~5.000 µg/µL之间；于伟伟等^[10]从南海仙掌藻、蕨藻以及伴绵藻中分离出36株海洋放线菌，对欧文斯氏弧菌等10种海洋病原性细菌进行抑菌试验，结果表明，36株放线菌均至少对1种病原细菌有抗菌活性，且部分放线菌的抗菌活性优于阳性对照卡那霉素。由此可见，海洋放线菌在弧菌等水产养殖病原细菌的防治中具有一定的应用潜力。

本研究分离获得的海藻共附生放线菌对水产养殖病原细菌，包括无乳链球菌、溶藻弧菌、欧文氏弧菌、海豚链球菌和美人鱼发光杆菌等均表现出抗菌活性，为防治这些致病菌提供了新的选择，具有潜在的应用价值。

3.3　海藻共附生微生物次级代谢产物的研究进展与前景

自20世纪以来，很多学者开始关注海藻相关真菌的次级代谢产物，这些真菌能够产生多种新颖且具有生物活性的次级代谢产物。近年来，海藻相关放线菌的次级代谢产物也逐渐受到关注，如分离自褐藻的链霉菌S. cyaneofuscatus M-27能够产生抗肿瘤的化合物daunomycin和cosmomycin B，抗真菌的大环内酯类化合物maltophilin和聚酮类化合物germicidins A、B^[37]；S. carnosus M-40能产生具有抗炎、抗痨作用的lobophorine B和聚酮类化合物galtamycin B^[37]；S. sundarbansensis WR1L1S8能够产生抗细菌活性的phaechromycins B、C、E和1个新的聚酮化合物，其中新化合物对MRSA的MIC为6 µmol/L^[38]；马尾藻共附生放线菌Nocardiopsis sp. AS23C能够产生一个新的酚酸衍生物4-amino-6-methylsalicylic acid，该物质具有较强的抗细菌活性^[39]；小单孢菌（Micromonospora sp.）CNY-010能够产生大环内脂新霉素B^[39]。这些研究表明，海藻共附生微生物及其代谢产物在医药和农业等领域具有较好的应用前景。

本研究在抑菌活性试验中发现羽毛藻中分离获得的放线菌至少对1种供试病原细菌表现出抑制作用，并且对水产病原细菌欧文斯氏弧菌和无乳链球菌表现出较好的抑菌活性。对其中次级代谢产物丰富的菌株HZ057进行全基因组测序和次级代谢产物生物合成基因簇分析，发现该菌株的次级代谢产物生物合成基因簇中与已报道的去铁胺、germicidin以及保罗霉素等具有抗菌、抗肿瘤、抗癌、免疫抑制活性分子的生物合成基因簇类似，菌株HZ057可能产生类似结构的次级代谢产物从而发挥抗菌活性；此外，HZ075基因组中也有与已知代谢物生物合成基因簇相似性低或未预测到的基因簇，存在产生新颖结构次级代谢产物的可能。因此，进一步深入研究该菌株的次级代谢产物，有望发现具有重要生物活性的新型次级代谢产物，在水产病害防治上具有应用前景，为海洋药物或生物防治菌剂的研发提供新资源。

基金

收起

国家自然科学基金项目(82404490)
海南省重点研发专项(ZDYF2024XDNY229)
研究生创新课题(RHDYC-202415)

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2025年第46卷第6期

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文章信息

doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.06.024

接收时间：2025-01-08
首发时间：2026-06-24
出版时间：2025-06-25

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作者

出版历史

收稿日期：2025-01-08
录用日期：2025-02-21

基金

国家自然科学基金项目(82404490)

海南省重点研发专项(ZDYF2024XDNY229)

研究生创新课题(RHDYC-202415)

作者信息

^1.海南热带海洋学院，海南三亚　572000

^3.海南省海洋与渔业科学院/海南省热带海水养殖技术重点实验室，海南海口　571126

通讯作者:

^* 王蓉（WANG Rong），E-mail：wangrong1982@gmail.com

熊子君（XIONG Zijun），E-mail：xiongzijun@itbb.org.cn。

参考文献

分享链接

https://castjournals.cast.org.cn/joweb/rdzwxb/CN/10.3969/j.issn.1000-2561.2025.06.024

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本文的引用情况

2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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RefWorks
TxT

菌株Strain	培养基Medium	抑菌圈直径Antibacterial circle diameter/mm
HZ037	LM1	-	-	-	-	-	12	-	10	-
	LM3	-	-	-	-	-	11	-	10	-
HZ041	LM1	-	15	-	-	-	-	-	-	13
	LM3	-	14	-	-	-	-	-	-	14
HZ046	LM1	-	-	-	-	-	-	-	12	14
	LM3	-	-	-	-	-	-	-	12	13
HZ051	LM1	14	16	-	-	-	-	-	-	-
	LM3	15	16	-	-	-	-	-	-	-
HZ054	LM1	-	-	-	-	9	-	13	-	-
	LM3	-	-	-	-	9	-	13	-	-
HZ055	LM1	-	-	-	13	-	-	-	14	-
	LM3	-	-	-	12	-	-	-	14	-
HZ056	LM1	-	-	-	-	-	-	15	-	-
	LM3	-	-	-	-	-	-	15	-	-
HZ057	LM1	-	-	-	-	13	-	11	-	-
	LM3	-	-	-	-	12	-	10	-	-
HZ063	LM1	-	-	-	-	-	-	-	12	-
	LM3	-	-	-	-	-	-	-	12	-

菌株Strain

培养基Medium

抑菌圈直径Antibacterial circle diameter/mm

HZ037

LM1

LM3

HZ041

LM1

LM3

HZ046

LM1

LM3

HZ051

LM1

LM3

HZ054

LM1

LM3

HZ055

LM1

LM3

HZ056

LM1

LM3

HZ057

LM1

LM3

HZ063

LM1

LM3

模式菌Model bacteria	ANI/%	dDDH/%
S. djakartensis JCM 4957^T	94.27	56.00
S. swartbergensis HMC13^T	89.81	39.10
S. venetus JCM 31290^T	90.29	40.30
S. afghaniensis 772^T	89.81	39.10
S. africanus NRRLB-24243^T	89.59	38.60
S. azureuss ATCC 14921^T	89.68	38.40
S. caelestis DSM 40084^T	89.45	38.10
S. tuirus JCM 4255^T	88.87	36.00
S. massasporeus JCM 4139^T	88.73	36.20
S. hawaiiensis ATCC 12236^T	89.81	39.10
S. levis JCM 6924^T=NBRC 15423^T	88.38	35.50

模式菌Model bacteria

ANI/%

dDDH/%

S. djakartensis JCM 4957^T

94.27

56.00

S. swartbergensis HMC13^T

89.81

39.10

S. venetus JCM 31290^T

90.29

40.30

S. afghaniensis 772^T

89.81

39.10

S. africanus NRRLB-24243^T

89.59

38.60

S. azureuss ATCC 14921^T

89.68

38.40

S. caelestis DSM 40084^T

89.45

38.10

S. tuirus JCM 4255^T

88.87

36.00

S. massasporeus JCM 4139^T

88.73

36.20

S. hawaiiensis ATCC 12236^T

89.81

39.10

S. levis JCM 6924^T=NBRC 15423^T

88.38

35.50

序号No.	类型Type	已知最相似的集群The most similar cluster	相似度Similarity/%	参考文献Reference
1	NRPS-like
2	terpene	hopene	92	[16]
3	hydrogen-cyanide	aborycin	21	[17]
4	NI-siderophore	kinamycin	19	[18]
5	ectoine	ectoine	100	[19]
6	RiPP-like
7	terpene	geosmin	100	[20]
8	T1PKS, butyrolactone	4-hexadecanoyl-3-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-2H-furan-5-one	45
9	NI-siderophore	desferrioxamin B/desferrioxamine E	100	[21]
10	T1PKS, melanin	melanin	80	[22]
11	terpene	SCO-2138	14
12	T1PKS, butyrolactone	Thaxtomin D/thaxtomin A/thaxto-min C/thaxtomin B	16	[23]
13	NI-siderophore	paulomycin	11	[24]
14	RiPP-like, lanthipeptide-class-iii	informatipeptin	100
15	amglyccycl	spectinomycin	54	[25]
16	oligosaccharide, LAP, RRE-containing
17	terpene	albaflavenone		[25]
18	NRP-metallophore, NRPS	coelichelin	100	[25]
19	other	colibrimycin
20	butyrolactone, NRPS	cyclofaulknamycin		[26]
21	phenazine	phenazineSA/phenazine SB/phenazi-ne SC	37	[27]
22	triceptide
23	RiPP-like	granaticin	5	[28]
24	terpene	isorenieratene	100	[29]
25	butyrolactone	cyphomycin	5	[30]
26	melanin	melanin	42	[21]
27	T1PKS, NRPS
28	T2PKS	spore pigment	75	[31]
29	T3PKS	germicidin	100	[32]

序号No.

类型Type

已知最相似的集群The most similar cluster

相似度Similarity/%

参考文献Reference

NRPS-like

terpene

hopene

[16]

hydrogen-cyanide

aborycin

[17]

NI-siderophore

kinamycin

[18]

ectoine

100

[19]

RiPP-like

terpene

geosmin

100

[20]

T1PKS, butyrolactone

4-hexadecanoyl-3-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-2H-furan-5-one

NI-siderophore

desferrioxamin B/desferrioxamine E

100

[21]

T1PKS, melanin

melanin

[22]

terpene

SCO-2138

T1PKS, butyrolactone

Thaxtomin D/thaxtomin A/thaxto-min C/thaxtomin B

[23]

NI-siderophore

paulomycin

[24]

RiPP-like, lanthipeptide-class-iii

informatipeptin

100

amglyccycl

spectinomycin

[25]

oligosaccharide, LAP, RRE-containing

terpene

albaflavenone

[25]

NRP-metallophore, NRPS

coelichelin

100

[25]

other

colibrimycin

butyrolactone, NRPS

cyclofaulknamycin

[26]

phenazine

phenazineSA/phenazine SB/phenazi-ne SC

[27]

triceptide

RiPP-like

granaticin

[28]

terpene

isorenieratene

100

[29]

butyrolactone

cyphomycin

[30]

melanin

[21]

T1PKS, NRPS

T2PKS

spore pigment

[31]

T3PKS

germicidin

100

[32]

菌株Strain	菌株生长情况Growth status of strains
HZ037	+++	+++	+++	++	+	-	-	-
HZ041	+++	+++	+++	++	+	-	-	-
HZ046	+++	+++	+++	++	+	-	-	-
HZ051	+++	+++	+++	++	+	-	-	-
HZ053	+++	+++	+++	++	+	-	-	-
HZ054	+++	+++	+++	++	+	+	+	-
HZ057	+++	+++	+++	++	+	+	+	-
HZ055	+++	+++	+++	++	+	-	-	-
HZ063	+++	+++	+++	++	+	-	-	-

菌株Strain

菌株生长情况Growth status of strains

10%

12%

14%

HZ037

+++

HZ041

+++

HZ046

+++

HZ051

+++

HZ053

+++

HZ054

+++

HZ057

+++

HZ055

+++

HZ063

+++