热带作物学报

编号No.	基因ID Gene ID	蛋白名称Protein name	功能注释Function annotation
1	scaffold0198_606133	dehydrin 脱水素	response to stress 逆境胁迫响应
2	scaffold0137_967149	UDP-glucose 6-dehydrogenase 1 UDP-葡萄糖6-脱氢酶1	oxidation-reduction process 氧化还原过程
3	scaffold1603_54869	glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase A 甘油醛-3-磷酸脱氢酶A	oxidation-reduction process; Calvin cycle 氧化还原过程；卡尔文循环
4	scaffold0624_438647	sorbitol dehydrogenase 山梨醇脱氢酶	oxidation-reduction process; zinc ion binding 氧化还原过程；锌离子结合
5	scaffold0773_328521	serine/tdreonine-protein kinase AFC2 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AFC2	oxidation-reduction process; protein phosphorylation 氧化还原过程；蛋白质磷酸化
6	scaffold0442_10352	casein kinase 1-like protein HD16 酪蛋白激酶1类似蛋白HD16	protein phosphorylation 蛋白质磷酸化
7	scaffold1340_33382	FK506-binding protein 2 FK506结合蛋白2	protein folding 蛋白质折叠
8	scaffold0705_61387	importin-5 核输出蛋白5	intracellular protein transport 细胞内蛋白转运
9	scaffold0073_2290349	monosaccharide-sensing protein 2 单糖感应蛋白2	transmembrane transport 跨膜转运
10	scaffold0008_4136903	copper-transporting ATPase PAA1 铜转运ATP酶PAA1	metal ion transport 金属离子转运
11	scaffold0840_283341	fructose-bisphosphate aldolase 6 果糖-1, 6-二磷酸醛缩酶6	glycolytic process; Calvin cycle 糖酵解过程；卡尔文循环
12	scaffold0297_1099976	ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基	carbon fixation 碳固定
13	scaffold0484_894238	adenosylhomocysteinase 腺苷同型半胱氨酸水解酶	one-carbon metabolic process 单碳代谢过程
14	scaffold0400_649822	ATP syntdase F1 subunit 1 ATP合成酶F1亚基	ATP metabolic process ATP代谢过程
15	scaffold0345_829597	ruvB-like 2	ATP binding ATP结合
16	scaffold0023_2452670	metE 5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸同型半胱氨酸甲基转移酶	metdionine biosyntdetic process 蛋氨酸生物合成过程
17	scaffold0129_624152	UDP-3-O-acylglucosamine N-acyltransferase 2 UDP-3-O-酰基葡糖胺N-酰基转移酶2	lipid A biosyntdetic process 脂质A生物合成过程
18	scaffold2021_36234	purple acid phosphatase 17 紫色酸性磷酸酶17	phosphate ion homeostasis 磷酸根离子稳态
19	scaffold0152_1754460	purple acid phosphatase 18 紫色酸性磷酸酶18	phosphate ion homeostasis 磷酸根离子稳态
20	scaffold1504_16442	EG45-like domain containing protein 类EG45结构域包含蛋白	cell volume regulation 细胞体积调控
21	scaffold0025_2379668	RNA polymerase beta subunit RNA聚合酶β亚基	transcription; DNA binding 转录；DNA结合
22	XR_002493814.1	uncharacterized protein	unknown 未知
23	scaffold0803_390106	uncharacterized protein	unknown 未知
24	scaffold0432_789540	hypotdetical protein 假定蛋白	unknown 未知

编号No.	基因ID Gene ID	蛋白名称Protein name	功能注释Function annotation
1	scaffold0198_606133	dehydrin 脱水素	response to stress 逆境胁迫响应
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3	scaffold1603_54869	glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase A 甘油醛-3-磷酸脱氢酶A	oxidation-reduction process; Calvin cycle 氧化还原过程；卡尔文循环
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24	scaffold0432_789540	hypotdetical protein 假定蛋白	unknown 未知

橡胶树酵母双杂交文库构建及HbTRXy2互作蛋白筛选

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吴双 ¹^,² , 逯锐琳 ¹ , 何其光 ¹ , 袁坤 ¹ , 胡义钰 ¹ , 王真辉 ¹ , 刘进平 ² , 刘辉 ¹^,^*

热带作物学报 | 组学与生物技术 2025,46(6): 1279-1287

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热带作物学报 |组学与生物技术 2025 , 46 (6) : 1279 -1287

橡胶树酵母双杂交文库构建及HbTRXy2互作蛋白筛选

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吴双¹^,², 逯锐琳¹, 何其光¹, 袁坤¹, 胡义钰¹, 王真辉¹, 刘进平², 刘辉¹^,^*

作者信息

^1.中国热带农业科学院橡胶研究所/农业农村部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室/省部共建国家重点实验室培育基地–海南省热带作物栽培生理学重点实验室，海南海口　571101

^2.海南大学热带农林学院，海南海口　570228

通讯作者:

^* 刘辉（LIU Hui），E-mail：liuhui@catas.cn。

Construction of Yeast Two-Hybrid Library of Hevea brasiliensis and Screening of HbTRXy2 Interacting Proteins

Shuang WU¹^,², Ruilin LU¹, Qiguang HE¹, Kun YUAN¹, Yiyu HU¹, Zhenhui WANG¹, Jinping LIU², Hui LIU¹^,^*

Affiliations

^1.Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree, Ministry of Agriculture and Rural Affairs / State Key Laboratory Incubation Base for Cultivation & Physiology of Tropical Crops, Haikou, Hainan 571101, China

^2.School of Tropical Agriculture and Forestry, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China

出版时间: 2025-06-25 doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.06.001

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摘要

收起

硫氧还蛋白通过催化硫醇-二硫键交换反应调节靶蛋白的结构和功能，在维持细胞氧化还原稳态中发挥关键作用。前期研究证实橡胶树y型硫氧还蛋白HbTRXy2具有很强的抗氧化功能。为探究HbTRXy2调控抗氧化性的分子机制，本研究构建橡胶树酵母双杂交文库及HbTRXy2诱饵载体pGBKT7-HbTRXy2，并通过酵母双杂交筛选与HbTRXy2互作的蛋白。结果显示：本研究构建的次级文库重组率为100%，插入片段平均长度大于1000 bp，库容量为3.80×10⁶ CFU/mL；经检测，诱饵载体pGBKT7-HbTRXy2在酵母中无毒性和自激活活性，可用于酵母双杂交筛选；采用共转化法从构建的文库中筛选到与HbTRXy2互作的蛋白24个。生物信息学分析表明，这些候选互作蛋白的功能涉及氧化还原、逆境胁迫响应、ATP结合与代谢、卡尔文循环、单碳代谢、碳固定、蛋氨酸生物合成、脂质A生物合成、金属离子结合或转运、跨膜转运、细胞体积调控、磷酸根离子稳态、蛋白质磷酸化和蛋白质折叠等。本研究结果为深入解析HbTRXy2在橡胶树中的功能及其作用机理奠定基础。

关键词

橡胶树 / 硫氧还蛋白 / 酵母双杂交 / 酵母文库构建 / 互作蛋白

Abstract

收起

Thioredoxins play critical roles in the maintenance of cellular redox homeostasis by regulating the structure and function of the target proteins through catalyzing thiol-disulfide exchange reactions. Previous research has confirmed that the y-type thioredoxin HbTRXy2 of rubber tree (Hevea brasiliensis) has a strong antioxidant function. To investigate the molecular mechanism of HbTRXy2 in enhancing antioxidant defense, a yeast two-hybrid library of rubber tree and the bait vector pGBKT7-HbTRXy2 for HbTRXy2 were constructed, and the interacting proteins of HbTRXy2 were identified via yeast two-hybrid in this study. The results indicated that the secondary library constructed in this study had a recombination rate of 100%, an average length of inserted fragments greater than 1000 bp, and a capacity of approximately 3.80×10⁶ CFU/mL. It was identified that the bait vector has no toxicity and self-activating activity in yeast and could be used for yeast two-hybrid screening. After testing, it was found that the bait vector had no toxicity and self-activating activity in yeast and could be used for yeast two-hybrid screening. Using the co-transformation method, 24 proteins interacting with HbTRXy2 were screened from the constructed library. Bioinformatics analysis revealed that the functions of the candidate interacting proteins encompassed redox processes, stress responses, ATP binding and metabolism, Calvin cycle, single-carbon metabolism, carbon fixation, methionine biosynthesis, lipid A biosynthesis, metal ion binding or transport, transmembrane transport, cell volume regulation, phosphate ion homeostasis, protein phosphorylation, protein folding, etc. The results would lay the foundation for further revealing the function and mechanism of HbTRXy2 in rubber tree.

Key words

rubber tree / thioredoxin / yeast two hybrid / yeast library construction / interacting protein

引用本文

吴双, 逯锐琳, 何其光, 袁坤, 胡义钰, 王真辉, 刘进平, 刘辉. 橡胶树酵母双杂交文库构建及HbTRXy2互作蛋白筛选. 热带作物学报, 2025 , 46 (6) : 1279 -1287 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.06.001

Shuang WU, Ruilin LU, Qiguang HE, Kun YUAN, Yiyu HU, Zhenhui WANG, Jinping LIU, Hui LIU. Construction of Yeast Two-Hybrid Library of Hevea brasiliensis and Screening of HbTRXy2 Interacting Proteins[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2025 , 46 (6) : 1279 -1287 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.06.001

正文

收起

硫氧还蛋白（thioredoxins，TRXs）是一类多基因家族编码的低分子量的氧化还原酶，含有高度保守的WC（G/P）PC基序，可通过催化硫醇-二硫键交换反应调节靶蛋白的结构和功能，在维持植物细胞氧化还原稳态中发挥关键作用^[1-4]。根据蛋白氨基酸序列同源性和亚细胞定位的不同，植物TRXs被划分为8种类型：h、f、m、o、s、x、y和z^[2,4]。其中，h型TRXs定位于细胞质、细胞核、内质网、线粒体等多种亚细胞结构中^[3-4]，o型TRXs定位于线粒体或细胞核中，s型TRXs定位于内质网中，而f、m、x、y和z型TRXs定位于质体中。研究表明，质体TRXs在叶绿体光合作用和胁迫应答中发挥重要作用，且不同类型的质体TRXs行使不同的功能^[5-7]。x和y型TRXs具有抗氧化功能，f和m型TRXs主要参与光合碳代谢的调节，而z型TRXs的作用似乎仅限于质体基因表达的调控^[3,8]。

拟南芥含有2个y型TRXs：AtTRXy1和AtTRXy2^[9]。体外生化试验表明，AtTRXy1和AtTRXy2是过氧化物酶Prx Q、甲硫氨酸亚砜还原酶MSR B2等抗氧化酶的还原底物^[9-10]。AtTRXy1还是质体葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G6PDH1的有效激活剂^[11]，AtTRXy2是单脱氢抗坏血酸还原酶MDHAR6的激活剂^[1]。在正常条件下，atrxy1和atrxy2突变体及其双突变体植株生长发育与野生型相似，但对干旱的敏感性增加^[1]；强光条件下，atrxy2突变体及atrxy1 atrxy2双突变体较野生型生长减缓，叶绿素含量降低^[10]。OKEGAWA等^[12]研究证实，y型TRXs通过调节光系统（IPSI）受体侧的氧化还原平衡在光合作用中发挥重要作用。此外，y型TRXs在调控种子在干旱或氧化胁迫下的发芽势中起着重要作用，但这种功能的行使并不归因于其抗氧化作用，而是通过调节植物激素实现^[13]。

橡胶树（Hevea brasiliensis）是重要的热带经济林木，其产生的胶乳是重要战略物资和工业原料天然橡胶的主要来源。刘辉等^[14]从橡胶树中克隆了1个y型TRX基因HbTRXy2，发现干旱、低温、盐以及氧化胁迫处理均能上调该基因的表达，并利用酵母表达系统证实HbTRXy2具有很强的抗氧化功能。为解析HbTRXy2调控抗氧化性的分子机制，本研究构建橡胶树非生物胁迫诱导的酵母双杂交文库，并通过酵母双杂交技术鉴定与HbTRXy2互作的蛋白。研究结果将为进一步揭示HbTRXy2调控抗氧化性的作用机理奠定基础。

1　材料与方法

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1.1　材料

选取健康、一致的橡胶树热研7-33-97组培苗（移栽培养约8个月）进行氧化和低温胁迫处理。氧化胁迫处理采用20 mmol/L的H₂O₂溶液，处理时将溶液喷施于植株所有的叶片。低温处理在4 ℃、16 h光照/8 h黑暗的人工气候箱中进行。在处理24 h时，采集胁迫处理以及未处理植株的叶片。选择种植于中国热带农业科学院试验农场六队的热研7-33-97健康和割面干涸（割面干涸率在70%左右）植株（树龄16 a），采集胶乳样品。同时，选择健康植株，涂施1.5%乙烯利，并于处理24 h时采集胶乳样品。上述叶片和胶乳采集后液氮冻存，用于总RNA提取。

1.2　方法

1.2.1　酵母双杂交文库的构建

（1）总RNA提取和mRNA的分离纯化。采用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取叶片和胶乳总RNA，具体提取方法参照试剂盒说明书。使用琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000超微量分光光度计（Thermo Scientific）检测RNA的完整性、纯度和浓度。采用Oligotex mRNA Midi Kit（Qiagen）分离纯化mRNA，并通过凝胶电泳检测分离纯化mRNA的质量。

（2）初级文库构建。cDNA第一链和第二链的合成参照CloneMiner II cDNA文库构建试剂盒（Invitrogen）。将重组接头连接到cDNA末端，并通过固定分级柱进行分级分离。参照Invitrogen公司Gateway BP Clonase II Enzyme Mix试剂盒说明书，通过BP重组反应将分级分离获得的cDNA重组至pDONR222载体上。采用电击转化的方法，将反应产物转入大肠杆菌DH10B菌株，获得初级文库菌。将50 μL 100倍稀释的初级文库菌涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB平板上，37 ℃培养过夜，统计生长出的单克隆数，并计算初级文库的库容量（CFU·mL^–1）和总克隆数（CFU）。随机挑取单克隆24个，采用M13-F（5′-GTAAAACGACGGCCAG-3′）和M13-R（5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′）引物进行菌落PCR鉴定。PCR采用EasyTaq DNA Polymerase（北京全式金生物技术有限公司），具体反应体系和程序参照其说明书。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

（3）次级文库构建。抽提初级文库和pGADT7-DEST载体的质粒，参照Gateway LR Clonase II Enzyme mix试剂盒（Invitrogen）说明书将二者进行LR重组，并通过电击转化法将重组产物转入大肠杆菌DH10B菌株，获得次级文库菌。将50 μL 100倍稀释的次级文库菌涂布于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB平板上，37 ℃培养过夜，统计生长出的单克隆数，并计算次级文库的库容量（CFU/mL）和总克隆数（CFU）。随机挑取单克隆24个，采用T7-F（5′-TAATACGACTCACTATAGGGC-3′）AD-R（5′-AGATGGTGCACGATGCACAG-3′）引物进行菌落PCR鉴定。PCR采用EasyTaq DNA Polymerase（北京全式金生物技术有限公司），具体反应体系和程序参照其说明书。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。抽提次级文库菌质粒，并检测其质量和浓度。

1.2.2　 HbTRXy2诱饵载体的构建、毒性及自激活活性分析

（1）构建HbTRXy2诱饵载体。根据HbTRXy2全长序列（XM_021825437.1）设计基因克隆的引物，并添加Nco Ⅰ和Sal Ⅰ酶切位点及保护碱基。正向引物HbTRXy2-F：5′-TACCATGGCTATGGCGATTTCTTCTCTCTCG-3′，反向引物HbTRXy2-R：5′-ACGTCGACACCTCAACTATTGCTTCACTTGC-3′。以橡胶树热研7-33-97叶片cDNA为模板，采用TransStart FastPfu DNA Polymerase（北京全式金生物），进行PCR扩增。采用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。切胶回收目标片段，与pEASY-Blunt Simple Cloning Vector连接，并转化大肠杆菌。经菌落PCR筛选，送3个阳性单克隆到公司进行测序。将测序正确的阳性菌液扩大培养，采用Plasmid Mini Kit I（OMEGA）提取质粒并进行Nco Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切，回收目标片段。抽提酵母表达载体pGBKT7质粒，Nco Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切，回收大片段。采用T4 DNA Ligase（Thermo Scientific）将HbTRXy2基因与pGBKT7载体连接，获得诱饵载体pGBKT-7-HbTRXy2。将连接产物转入大肠杆菌DH5α，菌落PCR筛选阳性克隆，并抽提其质粒。

（2）诱饵载体毒性和自激活检测。通过PEG/LiAc法将pGBKT7-HbTRXy2质粒转入酵母菌株Y2HGold，挑选单克隆3个，参照酵母质粒提取试剂盒（OMEGA）说明书提取质粒。使用EasyTaq DNA Polymerase（北京全式金生物技术有限公司）进行PCR鉴定，引物采用T7-F和HbTRXy2-R。以pGBKT7-HbTRXy2质粒作为阳性对照。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

将实验室保存的Y2HGold[pGBKT7]（空载体对照，CK）、Y2HGold[pGBKT7-53+pGADT7-T]（阳性对照，CK⁺）、Y2HGold[pGBKT7-Lam+pGADT7-T]（阴性对照，CK^–）以及Y2HGold [pGBKT7-HbTRXy2]酵母菌划线活化。挑单克隆，30 ℃，200 r/min培养24 h，分别划线于SD/-Trp/X-α-Gal/AbA、SD/-Trp/X-α-Gal和SD/-Trp平板上。30 ℃培养3 d，观察比较各酵母菌的生长差异。

1.2.3　HbTRXy2互作蛋白的筛选及功能注释

Y2H Gold酵母感受态细胞的制备参照Yeastmaker Yeast Transformation System 2 User Manual（Clontech）。将10 μg酵母文库质粒、5 μg pGBKT7-HbTRXy2质粒与20 μL预变性的Carrier DNA共转化感受态细胞。将转化菌液涂布于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基上，30 ℃培养5 d，进行初筛。将初筛平板上长出的约2 mm的单克隆转接至含有SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-gal/AbA的平板上，30 ℃培养5 d，进一步进行高严谨度筛选。采用Matchmaker Insert Check PCR Mix 2（Clontech）对生长出的蓝色单克隆进行酵母菌落PCR，PCR体系和扩增程序参照其说明书。取PCR产物5 μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，挑选扩增出单一条带的，将其PCR产物送至海南楠山生物技术有限公司进行测序。将测序结果在橡胶树基因组数据库HeveaDB（http://hevea.catas.cn/home/index）和NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）数据库中进行Blast分析，获取互作蛋白基因的ID及功能注释等信息。

2　结果与分析

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2.1　总RNA的提取及mRNA的分离

提取经低温、H₂O₂处理和无处理的橡胶树组培苗叶片以及健康、割面干涸和乙烯利处理橡胶树胶乳的总RNA，采用琼脂糖凝胶电泳以及微量分光光度计检测其质量和浓度，结果显示，各RNA样本A_260/280值介于1.8~2.1之间，28S、18S和5S rRNA条带清晰，无明显降解（图1A），质量符合建库要求。将各RNA等量混合，并进一步分离纯化mRNA及合成双链cDNA。电泳检测结果显示，纯化得到的mRNA以及合成的双链cDNA条带清晰，呈弥散状均匀分布（图1B，图1C），质量较好，可用于后续文库构建。

2.2　酵母双杂交文库的构建及鉴定

将纯化获得的mRNA反转录合成双链cDNA，添加重组接头后，并通过BP反应连入pDONR222载体，转化大肠杆菌，得到cDNA初级文库菌液。取50 μL稀释100倍的文库菌液涂板，生长出的克隆总数约为2100个（图2A），初级文库库容量约为4.20×10⁶ CFU/mL，总克隆数为1.68×10⁷ CFU。菌落PCR结果显示，24个随机选取的单克隆均扩出单一条带，且片段平均长度超过1000 bp，重组率达100%（图2B），符合初级文库的质量要求。

通过电极转化法将初级文库质粒与pGADT7-DEST载体质粒LR反应产物转入大肠杆菌DH10B，获得次级文库菌液。取50 μL 100倍稀释后文库菌液涂板，生长出约1900个单菌落（图2C）。经计算，次级文库库容量约为3.80×10⁶ CFU/mL，总克隆数为1.52×10⁷ CFU。对24个随机选取的单菌落进行PCR鉴定，电泳结果显示，均扩增出条带，重组率达100%，平均插入片段长度超过1000 bp（图2D）。以上结果表明，所构建的文库质量很好，可进行酵母双杂交筛选。

2.3　 HbTRXy2诱饵载体构建及其毒性和自激活活性检测

根据HbTRXy2基因全长序列设计扩增完整编码区的引物，从橡胶树叶片cDNA中扩出了符合预期大小527 bp的条带（图3A）。经公司测序确定正确后，通过酶切连接的方法将HbTRXy2基因连接到载体pGBKT7，获得诱饵载体pGBKT7-HbTRXy2。将pGBKT7-HbTRXy2质粒转入Y2HGold酵母感受态细胞，挑取3个单克隆抽提质粒并进行PCR检测。琼脂糖凝胶电泳结果证实诱饵载体成功转化酵母细胞（图3B）。

将含有pGBKT7-HbTRXy2、pGBKT7（空载体对照）、pGBKT7-Lam+pGADT7-T（阴性对照）或pGBKT7-53+pGADT7-T（阳性对照）的Y2HGold酵母菌分别在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-gal和SD/-Trp/X-α-gal/AbA平板上划线培养。结果（图4）显示，4种酵母菌在SD/-Trp平板上均有生长，差异不明显，表明诱饵载体pGBKT7-HbTRXy2对酵母菌无毒性。在SD/-Trp/X-α-gal平板上，4种酵母菌均能正常生长，但仅有阳性对照酵母菌显蓝色。在SD/-Trp/X-α-gal/AbA平板上，仅有阳性对照酵母菌生长且显蓝色，表明诱饵载体pGBKT7-HbTRXy2在Y2HGold酵母菌株中无自激活活性，可用于酵母双杂交筛选。

2.4　HbTRXy2互作蛋白的筛选与分析

通过共转化将诱饵载体pGBKT7-HbTRXy2质粒和次级文库质粒一起转入Y2HGold酵母感受态细胞，涂布于SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His平板上进行初筛（图5A）。将初筛平板上生长出的克隆转接到SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-gal/AbA平板上，进行高严谨度筛选。52个克隆在SD/-Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-gal/AbA平板上生长，且呈蓝色（图5B）。采用Matchmaker Insert Check PCR Mix 2对阳性克隆进行菌落PCR扩增，回收纯化目标条带送公司测序。经序列比对分析，除去重复序列后，最终鉴定到24个与HbTRXy2互作的蛋白（表1）。对筛选到的互作蛋白进行功能注释发现，这些蛋白的生物学功能涉及氧化还原、逆境胁迫响应、ATP结合与代谢、卡尔文循环、单碳代谢、碳固定、蛋氨酸生物合成、脂质A生物合成、金属离子结合或转运、跨膜转运、细胞体积调控、磷酸根离子稳态、蛋白质磷酸化和蛋白质折叠等。

3　讨论

收起

蛋白质是基因功能的直接执行者，虽然一些蛋白质可以独立地行使功能，但大多数蛋白质需要与其他蛋白质互作才能充分发挥其功能。因此，研究蛋白质之间的相互作用已成为深入解析蛋白质的生物学功能及其作用机制的关键环节之一。酵母双杂交技术具有操作简单、成本低、高通量等优点，是鉴定蛋白与蛋白互作的最常用方法^[15]。在橡胶树研究中，利用该技术已筛选鉴定了与HbHDA6^[16]、HbMC1^[17]、HbPSKR2^[18]、HbSRPP7^[19]等互作的蛋白。利用酵母双杂交筛选与目标蛋白互作的蛋白，首先需要构建高质量的酵母cDNA文库，而文库的质量主要由RNA的完整性、文库库容等决定^[20]。为使文库包含的蛋白更多，本研究将ABA、H₂O₂、低温处理的叶片以及健康、割面干涸、乙烯利处理橡胶树的胶乳样品的总RNA等量混合，用于分离纯化mRNA及双链cDNA合成，并基于同源重组的方法构建了酵母cDNA文库。经鉴定，所构建的次级文库质量较好，文库重组率达100%，插入片段平均长度超过1000 bp，库容量约为3.80×10⁶ CFU/mL，总克隆数约为1.52×10⁷ CFU，达到了酵母双杂交筛选文库的质量要求。该文库的建立为通过酵母双杂交筛选与目标橡胶树蛋白互作的蛋白奠定了基础。

硫氧还蛋白通过还原靶蛋白的二硫键在植物氧化还原反应、光合作用、叶片衰老、逆境响应等过程中发挥重要作用^[1-4,21]。鉴定硫氧还蛋白的靶蛋白将有助于揭示其作用机理。目前，已鉴定了一些能与硫氧还蛋白互作的蛋白。ARSOVA等^[22]采用酵母双杂交筛选到与239个克隆与拟南芥TRXz互作，并进一步通过BIFC（双分子荧光互补）等证实TRXz与类果糖激酶FLN1和FLN2互作。酵母双杂交、BIFC、pull-down与Co-IP（免疫共沉淀）证实，番茄SlTrxh与过氧化物氧还蛋白SlPrx存在互作^[23]。体外和植物体内试验也表明，拟南芥TRXy2能与2-半胱氨酸过氧化物氧还蛋白（2-Cys Prx）互作^[24]。前期研究中，本团队从橡胶树中克隆鉴定了一个受非生物胁迫诱导的y型TRX基因HbTRXy2，并证实在酵母中超量表达该基因能提高重组酵母的抗氧化性^[14]。为鉴定HbTRXy2的靶蛋白，进一步解析HbTRXy2调控抗氧化性的作用机制，本研究构建了HbTRXy2的诱饵载体，并通过酵母双杂交筛选获得24个可能与HbTRXy2互作的蛋白，其中，UDP-葡萄糖6-脱氢酶1（scaffold0137_967149）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶A（scaffold1603_54869）、山梨醇脱氢酶（scaffold0624_438647）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AFC2（scaffold0773_328521）和脱水素（scaffold0198_606133）与氧化还原和胁迫应答相关。推测HbTRXy2可能通过与这些蛋白互作在抗氧化性中发挥作用。已有研究证实，芍药甘油醛-3-磷酸脱氢酶PlGAPC2能通过提高NAD⁺的含量抑制高温条件下活性氧的（ROS）产生^[25]。过表达拟南芥山梨醇脱氢酶SDH能提高转基因株系对盐胁迫和渗透胁迫的抗性^[26]。在烟草中过表达高粱脱水素基因SbDhn1和SbDhn2均能增强转基因株系的抗氧化性^[27]。

功能注释表明，筛选到的与HbTRXy2互作的24个蛋白涉及氧化还原、逆境胁迫响应、ATP结合与代谢、糖酵解、单碳代谢、碳固定、卡尔文循环、蛋氨酸生物合成、脂质A生物合成、金属离子结合或转运、跨膜转运、细胞体积调控、磷酸根离子稳态、蛋白质磷酸化和蛋白质折叠等。其中，单碳代谢、碳固定、卡尔文循环、ATP结合与代谢等均与光合作用密切相关。核酮糖-1,5二磷酸羧化酶是植物催化CO₂固定的关键酶，决定着光合作用中碳同化速率，由多个大亚基和多个小亚基组成^[28]。叶绿体3-磷酸甘油醛脱氢酶和果糖1,6-二磷酸醛缩酶光合作用中参与卡尔文循环的重要酶^[29-30]。本研究的酵母双杂交筛选结果显示，HbTRXy2与核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基（scaffold0297_1099976）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶A（scaffold1603_54869）和果糖-1,6-二磷酸醛缩酶6（scaffold0840_283341）存在相互作用，表明HbTRXy2可能通过调节卡尔文循环参与光合作用。已有研究证实，叶绿体硫氧还蛋白系统在植物光合作用中发挥重要作用^[7-8,12]。本课题组前期的研究发现，HbTRXy2基因在叶片中高表达，且主要定位在叶绿体^[14]。叶绿体是进行光合作用的场所。根据HbTRXy2基因的表达特性以及与其互作蛋白的功能注释，推测HbTRXy2在橡胶树光合作用中发挥重要作用。

4　结论

收起

本研究构建了库容量为3.80×10⁶ CFU/mL、平均插入片段长度大于1000 bp的高质量橡胶树酵母双杂交文库，为筛选橡胶树功能基因的互作蛋白奠定基础；构建了具有抗氧化功能的硫氧还蛋白HbTRXy2的诱饵载体pGBKT7-HbTRXy2，并通过酵母双杂交筛选获得24个与HbTRXy2互作的蛋白，功能涉及氧化还原、逆境胁迫响应、ATP结合与代谢、糖酵解、单碳代谢、碳固定、卡尔文循环、蛋氨酸生物合成、脂质A生物合成、金属离子结合或转运、跨膜转运、细胞体积调控、磷酸根离子稳态、蛋白质磷酸化和蛋白质折叠等多种生物学进程，为进一步解析HbTRXy2的生物学功能及其作用的分子机制奠定基础。

基金

收起

海南省重点研发项目(ZDYF2024XDNY232)
国家自然科学基金面上项目(32371922)
中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(1630022023008)

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文献

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2025年第46卷第6期

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doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.06.001

接收时间：2025-02-10
首发时间：2026-06-24
出版时间：2025-06-25

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收稿日期：2025-02-10
录用日期：2025-02-12

基金

海南省重点研发项目(ZDYF2024XDNY232)

国家自然科学基金面上项目(32371922)

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(1630022023008)

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^2.海南大学热带农林学院，海南海口　570228

通讯作者:

^* 刘辉（LIU Hui），E-mail：liuhui@catas.cn。

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

编号No.	基因ID Gene ID	蛋白名称Protein name	功能注释Function annotation
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2	scaffold0137_967149	UDP-glucose 6-dehydrogenase 1 UDP-葡萄糖6-脱氢酶1	oxidation-reduction process 氧化还原过程
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5	scaffold0773_328521	serine/tdreonine-protein kinase AFC2 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AFC2	oxidation-reduction process; protein phosphorylation 氧化还原过程；蛋白质磷酸化
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7	scaffold1340_33382	FK506-binding protein 2 FK506结合蛋白2	protein folding 蛋白质折叠
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18	scaffold2021_36234	purple acid phosphatase 17 紫色酸性磷酸酶17	phosphate ion homeostasis 磷酸根离子稳态
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编号No.

基因ID Gene ID

蛋白名称Protein name

功能注释Function annotation

scaffold0198_606133

dehydrin
脱水素

response to stress
逆境胁迫响应

scaffold0137_967149

UDP-glucose 6-dehydrogenase 1
UDP-葡萄糖6-脱氢酶1

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氧化还原过程

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glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase A
甘油醛-3-磷酸脱氢酶A

oxidation-reduction process; Calvin cycle
氧化还原过程；卡尔文循环

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sorbitol dehydrogenase
山梨醇脱氢酶

oxidation-reduction process; zinc ion binding
氧化还原过程；锌离子结合

scaffold0773_328521

serine/tdreonine-protein kinase AFC2
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AFC2

oxidation-reduction process; protein phosphorylation
氧化还原过程；蛋白质磷酸化

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casein kinase 1-like protein HD16
酪蛋白激酶1类似蛋白HD16

protein phosphorylation
蛋白质磷酸化

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FK506-binding protein 2
FK506结合蛋白2

protein folding
蛋白质折叠

scaffold0705_61387

importin-5
核输出蛋白5

intracellular protein transport
细胞内蛋白转运

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monosaccharide-sensing protein 2
单糖感应蛋白2

transmembrane transport
跨膜转运

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copper-transporting ATPase PAA1
铜转运ATP酶PAA1

metal ion transport
金属离子转运

scaffold0840_283341

fructose-bisphosphate aldolase 6
果糖-1, 6-二磷酸醛缩酶6

glycolytic process; Calvin cycle
糖酵解过程；卡尔文循环

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ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase
large subunit核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基

carbon fixation
碳固定

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adenosylhomocysteinase
腺苷同型半胱氨酸水解酶

one-carbon metabolic process
单碳代谢过程

scaffold0400_649822

ATP syntdase F1 subunit 1
ATP合成酶F1亚基

ATP metabolic process
ATP代谢过程

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ruvB-like 2

ATP binding
ATP结合

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metE
5-甲基四氢蝶酰三谷氨酸同型半胱氨酸甲基转移酶

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蛋氨酸生物合成过程

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UDP-3-O-酰基葡糖胺N-酰基转移酶2

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purple acid phosphatase 17
紫色酸性磷酸酶17

phosphate ion homeostasis
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purple acid phosphatase 18
紫色酸性磷酸酶18

phosphate ion homeostasis
磷酸根离子稳态

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EG45-like domain containing protein
类EG45结构域包含蛋白

cell volume regulation
细胞体积调控

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RNA polymerase beta subunit
RNA聚合酶β亚基

transcription; DNA binding
转录；DNA结合

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uncharacterized protein

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scaffold0803_390106

uncharacterized protein

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未知

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未知