热带作物学报

引物名称Primer name	引物序列（5′-3′）Primer sequence (5′-3′)
HbPP2-A13.2-F	TGGACAATCCTGGGAACTGG
HbPP2-A13.2-R	TGTGCTCATCTCACTGCCTA
HbPP2-B13-F	TGACAACAGCAGCTTATGG
HbPP2-B13-R	CAATCTCCAGCCACCCATC
HbPP2-B1.1-F	GCTGAAGGTTGTAAGCGAAGTT
HbPP2-B1.1-R	GTGGCGGAATAACCCGACTT
HbPP2-B10.1-F	GAACTGGTTGGAGGCGTGAA
HbPP2-B10.1-R	TTCCGTTTTCGGTCTCATCTCT
HbPP2A15.1-F	TGACGCCACCAGAGATTTGT
HbPP2A15.1-R	CCATCGTCAAATGGAACGGGA
HbPP2A14.1-F	GTGGAGGTCCTTCTCCATCAA
HbPP2A14.1-R	CGTCTCCCACACAAAATCGG

引物名称Primer name	引物序列（5′-3′）Primer sequence (5′-3′)
HbPP2-A13.2-F	TGGACAATCCTGGGAACTGG
HbPP2-A13.2-R	TGTGCTCATCTCACTGCCTA
HbPP2-B13-F	TGACAACAGCAGCTTATGG
HbPP2-B13-R	CAATCTCCAGCCACCCATC
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HbPP2A15.1-R	CCATCGTCAAATGGAACGGGA
HbPP2A14.1-F	GTGGAGGTCCTTCTCCATCAA
HbPP2A14.1-R	CGTCTCCCACACAAAATCGG

蛋白Protien	基因ID Gene ID	氨基酸个数Number of amino acids	分子质量Molecular weight/kDa	等电点pI	不稳定系数Instability index	亲水系数GRAVY
HbPP2-B1	scaffold0016_1581782	198	22.829	5.48	36.08	-0.608
HbPP2-A15	scaffold0020_30195	296	33.407	6.25	49.35	-0.313
HbPP2-A12	scaffold0082_457438	172	19.697	7.62	31.82	-0.178
HbPP2-A14	scaffold0148_1285467	285	32.384	6.65	50.70	-0.284
HbPP2-B13	scaffold0178_461591	140	15.530	9.64	48.08	-0.500
HbPP2-B15	scaffold0340_117358	538	61.206	7.03	47.91	-0.456
HbPP2-B15.1	scaffold0340_123434	231	26.018	5.37	46.87	-0.324
HbPP2-A13	scaffold0425_531538	290	32.903	6.20	46.35	-0.373
HbPP2-A13.1	scaffold0425_534088	290	32.958	6.36	47.87	-0.386
HbPP2-B10	scaffold0429_412565	170	19.614	7.83	47.37	-0.245
HbPP2-B10.1	scaffold0594_96082	201	23.027	5.54	40.93	-0.297
HbPP2-A15.1	scaffold0753_521075	294	33.394	5.94	55.04	-0.370
HbPP2-A13.2	scaffold0782_510591	290	32.886	6.38	35.09	-0.273
HbPP2-A12.1	scaffold0976_68746	295	33.524	9.06	41.26	-0.265
HbPP2-A14.1	scaffold0997_310741	285	32.328	7.99	51.38	-0.248
HbPP2-B11	scaffold1141_68043	83	9.402	8.74	35.23	0.206
HbPP2-B1.1	scaffold1150_191714	335	37.344	5.14	42.82	-0.444

蛋白Protien	基因ID Gene ID	氨基酸个数Number of amino acids	分子质量Molecular weight/kDa	等电点pI	不稳定系数Instability index	亲水系数GRAVY
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HbPP2-B1.1	scaffold1150_191714	335	37.344	5.14	42.82	-0.444

蛋白Protien	亚细胞定位Subcellular localization	α-螺旋Alpha helix/%	β-转角Beta turn/%	延伸链Extended strand/%	无规则卷曲Random coil/%
HbPP2-B1	Chloroplast, Cytoplasm	12.63	5.05	27.78	54.55
HbPP2-A15	Cell membrane, Chloroplast	25.34	7.09	27.03	40.54
HbPP2-A12	Cell membrane, Chloroplast	16.28	9.88	38.37	35.47
HbPP2-A14	Chloroplast	26.67	7.02	24.21	42.11
HbPP2-B13	Chloroplast	10.71	7.14	22.86	59.29
HbPP2-B15	Nucleus	28.44	4.65	23.42	43.49
HbPP2-B15.1	Nucleus	27.27	4.33	21.65	46.75
HbPP2-A13	Chloroplast	22.76	5.17	28.28	43.79
HbPP2-A13.1	Chloroplast	23.45	5.86	26.21	44.48
HbPP2-B10	Chloroplast	14.71	4.71	29.41	51.18
HbPP2-B10.1	Cytoplasmic	9.95	8.46	35.32	46.27
HbPP2-A15.1	Nuclear	25.17	6.80	25.85	42.18
HbPP2-A13.2	Nuclear	22.07	6.21	26.55	45.17
HbPP2-A12.1	Cytoplasmic	24.75	4.75	25.08	45.42
HbPP2-A14.1	Nuclear	22.81	6.32	28.77	42.11
HbPP2-B11	Cytoplasmic	16.87	7.23	42.17	33.73
HbPP2-B1.1	Nuclear	22.39	5.67	23.88	48.06

蛋白Protien	亚细胞定位Subcellular localization	α-螺旋Alpha helix/%	β-转角Beta turn/%	延伸链Extended strand/%	无规则卷曲Random coil/%
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HbPP2-A15	Cell membrane, Chloroplast	25.34	7.09	27.03	40.54
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HbPP2-A14	Chloroplast	26.67	7.02	24.21	42.11
HbPP2-B13	Chloroplast	10.71	7.14	22.86	59.29
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HbPP2-B1.1	Nuclear	22.39	5.67	23.88	48.06

巴西橡胶树HbPP2基因家族鉴定与表达分析

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杨那 ¹^,² , 林远 ³ , 胡斌 ³ , 郝园园 ³ , 韩晓菲 ¹ , 刘林娅 ²^,^* , 龙翔宇 ³^,^*

热带作物学报 | 组学与生物技术 2025,46(4): 777-787

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热带作物学报 |组学与生物技术 2025 , 46 (4) : 777 -787

巴西橡胶树HbPP2基因家族鉴定与表达分析

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杨那¹^,², 林远³, 胡斌³, 郝园园³, 韩晓菲¹, 刘林娅²^,^*, 龙翔宇³^,^*

作者信息

^1.大连大学生命健康学院，辽宁大连　116622

^2.六盘水师范学院生物科学与技术学院，贵州六盘水　553004

^3.中国热带农业科学院橡胶研究所/农业农村部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室，海南海口　571101

通讯作者:

^* 刘林娅（LIU Linya），E-mail：liulinya913@126.com

龙翔宇（LONG Xiangyu），E-mail：yuxianglong006@163.com。

Identification and Expression Analysis of HbPP2 Gene Family in Hevea brasiliensis

Na YANG¹^,², Yuan LIN³, Bin HU³, Yuanyuan HAO³, Xiaofei HAN¹, Linya LIU²^,^*, Xiangyu LONG³^,^*

Affiliations

^1.School of Life and Health, Dalian University, Dalian, Liaoning 116622, China

^2.School of Biological Science and Technology, Liupanshui Normal University, Liupanshui, Guizhou 553004, China

^3.Institute of Rubber Research, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Haikou, Hainan 571101, China

出版时间: 2025-04-25 doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.04.001

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摘要

收起

橡胶树胶乳代谢过程受到多种机制调控，其中泛素化修饰调控最为显著。韧皮部蛋白PP2属于F-box蛋白家族，在胶乳中特异性高表达，可能参与了胶乳再生调控。本研究对巴西橡胶树基因组中鉴定到的17个F-box成员HbPP2基因进行生物信息学和表达模式分析，结果表明：橡胶树PP2基因编码的蛋白大多数为不稳定亲水性蛋白，分子量介于9.402~61.206 kDa之间；系统进化分析表明巴西橡胶树中的17个HbPP2基因可以分为3个亚组（Ⅰ亚组，Ⅱ亚组和Ⅲ亚组），其中HbPP2成员在Ⅰ亚组中完全缺失；顺式作用元件分析发现，PP2基因启动子区域包含生长发育调控、激素响应和光响应等多种顺势作用元件；亚细胞定位预测发现，PP2蛋白主要定位在叶绿体或细胞质中；表达分析显示，橡胶树HbPP2家族中除部分成员具有组织表达特异性外，多数成员在各个组织中均有表达，在胶乳中，HbPP2-B1、HbPP2-B1.1、HbPP2-B10.1、HbPP2-A13.2、HbPP2-B13和HbPP2-A15.1的表达丰度较高，但割胶处理只显著上调HbPP2-A13.2和HbPP2-B13的表达。本研究初步揭示巴西橡胶树HbPP2家族成员的理化特征和表达特征，为进一步研究该基因家族在橡胶树胶乳合成代谢中的功能奠定基础。

关键词

巴西橡胶树 / 基因表达分析 / 韧皮部蛋白2 / PP2基因家族 / 胶乳生物合成

Abstract

收起

Rubber tree latex metabolic processes are regulated by a variety of mechanisms, among which ubiquitination modification is the most significant. The phloem protein PP2 belongs to the F-box protein family and is specifically highly expressed in latex, which may be involved in the regulation of latex regeneration. In this study, bioinformatics and expression pattern analysis were conducted on 17 F-box members of the HbPP2 gene identified in the genome of Hevea brasiliensis. The results revealed that the majority of proteins encoded by the rubber tree PP2 genes were unstable hydrophilic proteins with molecular weights ranging from 9.402 to 61.206 kDa. Phylogenetic analysis showed that the 17 HbPP2 genes in the H. brasiliensis could be divided into three subgroups (Subgroup Ⅰ, Subgroup Ⅱ, Subgroup Ⅲ), in which HbPP2 members were completely absent in subgroup I. Analysis of cis-acting elements revealed that the rubber tree PP2 gene family contained diverse functional elements involved in growth and development regulation, hormone response, and light response. Subcellular localization analysis indicated that PP2 proteins were primarily localized in chloroplasts or cytoplasm. Tissue expression analysis showed that, except for some members with tissue-specific expression, most members of the rubber tree HbPP2 family were expressed in various tissues. In latex, the expression levels of six genes, HbPP2-B1, HbPP2-B1.1, HbPP2-B10.1, HbPP2-A13.2, HbPP2-B13 and HbPP2-A15.1, were relatively high, but tapping treatment significantly upregulated the expression of HbPP2-A13.2 and HbPP2-B13. This study would provide preliminary insights into the physicochemical and expression characteristics of the HbPP2 family members in the H. brasiliensis, laying a foundation for further research on the functions of this genes family in rubber trees latex synthesis and metabolism.

Key words

Hevea brasiliensis / gene expression analysis / phloem protein 2 / PP2 genes family / natural rubber biosynthesis

引用本文

杨那, 林远, 胡斌, 郝园园, 韩晓菲, 刘林娅, 龙翔宇. 巴西橡胶树HbPP2基因家族鉴定与表达分析. 热带作物学报, 2025 , 46 (4) : 777 -787 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.04.001

Na YANG, Yuan LIN, Bin HU, Yuanyuan HAO, Xiaofei HAN, Linya LIU, Xiangyu LONG. Identification and Expression Analysis of HbPP2 Gene Family in Hevea brasiliensis[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2025 , 46 (4) : 777 -787 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.04.001

正文

收起

F-box蛋白是SCF类E3泛素连接酶的重要组成部分，通过与其他蛋白结合形成复合物，完成泛素化修饰的调控，进而参与植物生长发育、激素信号转导、生物胁迫和非生物胁迫等生物过程^[1-4]。已有研究表明，拟南芥（Arabidopsis thaliana）F-box基因编码的生长素受体蛋白和茉莉酸受体蛋白能够和其他蛋白形成复合体从而调控植物的生长发育和逆境应答；葡萄（Vitis vinifera L.）F-box基因BIG-24.1受到激素SA、ABA、MeJA和损伤胁迫的强烈诱导；小麦（Triticum aestivum L.）F-box蛋白TaFBA1通过与胁迫相关蛋白的相互作用来调节其对干旱和盐胁迫的耐受性。

韧皮部组织不仅在光合产物、大分子和小分子物质的长距离运输中起着重要的作用^[5-7]，也在植物应答各种外部刺激（机械损伤、昆虫攻击和真菌感染等）产生防御反应的过程中发挥核心作用^[8-14]。韧皮部蛋白（phloem protein，PP）是韧皮部中含量最为丰富的一种蛋白，分为韧皮部蛋白PP1（phloem protein，PP1）和韧皮部蛋白PP2（phloem protein，PP2）^[15-17]。PP2主要存在于高等植物韧皮部中，已有研究发现同物种之间的PP2蛋白大小差异明显，主要是由保守结构域延伸的N端长度的可变性造成。如南瓜属植物PP2基因家族由2~8个基因构成^[18]，拟南芥中发现30个PP2基因，编码蛋白长度131~479个氨基酸^[19]，苎麻（Boehmeria nivea L. Gaudich）中发现15个PP2基因，编码蛋白长度为177~441个氨基酸^[20]。PP2蛋白的功能较广泛，不同植物中的PP2蛋白功能不尽相同。在南瓜（Cucurbita moschata）的韧皮部汁液中发现了116个PP2蛋白与泛素介导的蛋白水解相关，因此研究者推测这些蛋白可能具有水解蛋白功能^[21]。在拟南芥中，F-box蛋白韧皮部蛋白AtPP2-B11作为SCF型E3连接酶的底物受体，负调控拟南芥对干旱胁迫的应答^[22]。因此，作为F-box家族成员韧皮部蛋白PP2，参与了植物生长发育以及抗性反应。

巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）属大戟科植物，原产于亚马逊河流域^[23-24]。其产生的胶乳是天然橡胶的主要来源。天然橡胶作为四大工业基础原料之一，在航空航天、医疗和军事等领域具有不可替代性。天然胶乳主要储存于韧皮部组织特化的乳管细胞中^[25]。本课题组在前期的研究中发现，乳管中特异性表达基因与泛素化修饰途径相关基因均显著上调^[26]，同时橡胶树不同组织蛋白泛素化修饰组及割胶处理胶乳蛋白修饰组的数据显示，乳管中泛素化修饰途径被显著富集（数据未发表），推测泛素化修饰是乳管中天然橡胶生物合成中重要的代谢调控方式，但具体作用机制尚不清楚。通过橡胶树不同组织转录组数据分析发现，PP2在胶乳中特异性高表达，并受割胶强烈诱导，推测PP2类基因可能通过泛素化修饰途径参与乳管中天然橡胶的生物合成调控。因此，本研究以巴西橡胶树（热研7-33-97）为试验材料，在全基因组水平鉴定PP2基因家族成员，对其成员的蛋白质理化性质、二级和三级结构、亚细胞定位、基因结构、顺式作用元件、系统进化和表达特征等方面进行分析，研究结果将拓展对橡胶树F-box基因家族的功能认知，为深入探究HbPP2基因家族在胶乳生物合成中的功能奠定基础。

1　材料与方法

收起

1.1　材料

本研究采用的实验材料种植于海南省儋州市中国热带农业科学院试验场的巴西橡胶树热研7-33-97。选取其不同组织（胶乳、叶片、种子、花、树皮和茎）以及不同割次[第1刀（1）、第2刀（2）、第3刀（3）、第5刀（5）、第7刀（7）和第9刀（9）]的胶乳抽提总RNA，并进行转录组测序。

1.2　方法

1.2.1　HbPP2基因家族成员鉴定及其理化性质分析

从橡胶树基因组数据库（http://hevea.catas.cn/home/index）中获取橡胶树基因组序列、蛋白质序列和注释信息文件，利用Pfam数据库（http://pfam.xfam.org/）下载PP2结构域（PF14299）的隐马尔可夫模型（HMM）文件，对橡胶树基因组数据库中含有PP2结构域的基因进行筛选，选取e值小于1e^-10的蛋白序列^[20]。从已有的转录组数据中根据结构域搜索PP2基因，对比橡胶树数据库去除重复后通过NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库的CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml）进行保守结构域分析，去除不含PP2结构域的候选序列，得到HbPP2基因家族成员。

1.2.2　HbPP2基因家族亚细胞定位及二、三级结构预测

利用ExPASy ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）在线分析工具进行氨基酸数量、分子量大小、等电点、不稳定系数和亲水系数预测。通过Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/#）在线分析工具对橡胶树PP2基因家族蛋白进行亚细胞定位。利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）在线分析工具分析蛋白质的二级结构。通过SWISS-MODEL（https://swissmodel.Expasy.org/）在线分析工具对橡胶树PP2基因家族的蛋白质序列进行三级结构模型预测。

1.2.3　 HbPP2基因结构、启动子顺式作用元件分析

根据橡胶树基因组的注释信息，利用NCBI Batch CD-search（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）在线分析工具搜索序列保守结构域，利用MEME（http://meme-suite.org/tools/meme）在线分析工具预测PP2家族基因的保守motif^[3]。截取HbPP2转录起始位点上游2 kb的序列作为启动子序列进行分析，利用PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在线分析工具预测启动子序列的顺式作用元件^[27]，并通过TBtools软件对预测的结果进行可视化展示^[28]。

1.2.4　HbPP2基因家族系统进化分析

通过PlantTFdb（http://planttfdb.gao-lab.org/index.php）数据库和NCBI数据库下载拟南芥、木薯（Manihot esculenta）的PP2蛋白序列与HbPP2组成分析蛋白序列集，通过MEGA-X软件采用邻接法（neighbor-joiningmethod，NJ）构建系统进化树^[29]，并使用evolview（https://www.evolgenius.info/evolview-v2/#mytrees/SHOWCASES/showcase%2001）在线分析工具进行结果优化。

1.2.5　 HbPP2基因差异表达分析

所有RNA样品均采用Hiseq平台进行转录组测序，去除污染和低质量读长后进行基因组比对，利用RSEM软件包对橡胶树不同组织、不同割次胶乳的HbPP2基因家族成员进行表达分析，获得每个基因的reads count、FPKM及TPM值，将FPKM值取以2为底的对数，用TBtools软件绘制热图。

根据转录组数据挑选6个表达趋势显著的HbPP2家族成员基因，利用NCBI Primer 3.0（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome）在线网站设计特异性引物（表1）。用TransZol Plant RNA提取试剂盒（ET121）分别提取5个组织（胶乳、花、茎、树皮和叶）的总RNA和不同割胶处理（第1刀、第3刀、第5刀、第9刀）胶乳的总RNA。取1 μg总RNA用PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行逆转录得到cDNA。以cDNA为模板，YLS8为内参基因，用2×Q3 SYBR qPCR Master Mix（Universal）（TOLOBIO，China）进行qPCR实验，反应体系和程序按照说明书进行，结果按照2^–ΔΔCt法计算。

2　结果与分析

收起

2.1　HbPP2基因家族成员鉴定及理化性质分析

基于橡胶树数据库和转录组数据的比对筛选结果，共得到17个PP2蛋白编码基因。通过CDD数据库分析发现PP2含有保守结构域，命名如表2所示。进一步分析发现，HbPP2蛋白之间差异较大，蛋白分子量介于9.402~61.206 kDa之间，等电点介于5.14~9.64之间，其中10个为酸性蛋白，7个为碱性蛋白（表2）。根据蛋白亲疏水性指标，大部分HbPP2基因编码的蛋白亲水性平均系数在-0.608~-0.178之间，属于亲水性蛋白，HbPP2-B11的亲水性平均系数为正值，属于疏水性蛋白。HbPP2蛋白的不稳定系数介于31.82~55.04之间，其中HbPP2-B1、HbPP2-A12、HbPP2-A13.2和HbPP2-B11的不稳定系数小于40，属于稳定蛋白，其余13个均为不稳定蛋白。

2.2　HbPP2蛋白亚细胞定位及二、三级结构预测

对HbPP2基因家族编码蛋白进行亚细胞定位预测，结果显示有5个家族成员定位于叶绿体，6个成员定位于细胞核，3个成员定位于胞质，2个成员定位于细胞膜和叶绿体，1个成员定位于叶绿体和胞质（表3）。对HbPP2蛋白进行二级结构预测发现，有82%蛋白成员的二级结构主要由无规则卷曲和延伸链组成，18%成员的二级结构由无规则卷曲和α-螺旋组成（表3），与17个家族成员的三级结构预测结果基本一致（图1）。

2.3　 HbPP2基因结构分析

对橡胶树17个PP2基因进行多重序列比对并进行系统进化分析。结果显示17个基因被划分为2类。为进一步研究HbPP2基因结构特征，利用MEME软件对HbPP2家族成员进行保守基序分析。结果显示，在Ⅰ亚组中，除了HbPP2-A12缺失motif3和motif5，其余7个成员都包含了motif1~motif6；在Ⅱ亚组中，分别含有2~10个motif，多数都含有motif7、motif10、motif8和motif9；HbPP2-B13和HbPP2-B11相对其他成员缺失motif7、motif8和motif9，且与Ⅰ亚组成员极少有相同motif（图2A）。为了更加直观地呈现HbPP2蛋白的保守结构域及其分布，通过NCBI蛋白保守结构域数据库分析所有HbPP2家族成员氨基酸序列，结果显示HbPP2家族成员均含有PP2结构域（图2B）。F-box结构域位于HbPP2-A15、HbPP2-A15.1、HbPP2A14、HbPP2A13.2、HbPP2A13、HbPP2A13.1、HbPP2-A13.1、HbPP2-A12.1和HbPP2-B10.1靠近N端的位置（图2B）。通过橡胶树基因组注释文件和HbPP2氨基酸序列对17个家族成员进行基因结构（外显子和内含子）分析，结果表明，所有成员含有外显子数目在1~7个不等，不同基因序列长短存在差异，内含子和外显子的位置也存在差异。其中，HbPP2.A15.1基因序列最长，包含3个外显子；HbPP2-B15基因包含最多的外显子数，且基因两端均不含UTR区（图2C）。

2.4　 HbPP2基因启动子顺式作用元件分析

为进一步探究HbPP2基因家族的功能，分别截取17个HbPP2基因转录起始位点上游2000 bp序列作为启动子区，利用PlantCARE在线工具对启动子区进行顺式作用元件预测，共鉴定到21种启动子顺式作用元件（图3）。这些作用元件包含198个光响应元件、52个甲基茉莉酸响应元件、26个脱落酸响应元件、22个厌氧诱导元件、16个干旱诱导元件、13个生长素响应元件、12个赤霉素应答元件、6个分生组织表达元件、5个水杨酸响应元件和4个防御和胁迫应答元件。HbPP2-B1基因中只存在1个MYBhv1 binging site非生物胁迫响应元件。此外，部分家族成员还包含少数几个调控元件，如玉米素代谢调控元件、分生组织表达调控元件和昼夜节律调控元件等。

2.5　HbPP2基因家族进化分析

通过NCBI数据库和PlantTFdb数据库分别搜索模式植物拟南芥（30个）和木薯（19个）PP2氨基酸序列，与橡胶树17个PP2氨基酸序列进行比对并构建系统进化树。如图4所示，PP2家族可以分为3个亚组，其中拟南芥PP2的AtPP2-A成员分布于Ⅰ和Ⅱ亚组中，AtPP2-B成员仅分布在Ⅲ亚组，而橡胶树HbPP2家族成员仅分布在Ⅱ亚组和Ⅲ亚组中，分别与拟南芥的AtPP2-A和AtPP2-B聚集在一起。另外HbPP2大多数成员均与木薯聚集在Ⅱ亚组和Ⅲ亚组中的同一分支，表明其亲缘关系与木薯更为接近，这与物种进化上橡胶树与木薯亲缘关系最近相一致^[30]。

2.6　HbPP2基因家族成员表达分析

对橡胶树不同组织（花、茎、胶乳、树皮、叶片和种子）和不同割胶刀次（1、2、3、5、7、9）胶乳中的HbPP2基因表达水平进行分析（图5）。结果表明该基因家族成员具有显著的组织表达特异性。HbPP2-B15.1、HbPP2-B15、HbPP2-B10和HbPP2-A12.1在叶片中表达量较高，在胶乳中不表达或者低表达，且不受割胶处理诱导。HbPP2-A14.1、HbPP2-A14、HbPP2-A15和HbPP2-B11基因在茎中的表达量较高，但随着割胶刀次的增加，变化并不明显。在花组织中没有明显高表达的HbPP2基因。HbPP2-A13、HbPP2-A13.1和HbPP2-A12在树皮中呈现高表达趋势，但在割胶实验中的变化趋势恰好相反。在种子中表达量较高的基因HbPP2-B1.1、HbPP2-B1、HbPP2-B10.1和HbPP2-A13.2，在胶乳中同样也表现出高表达的趋势，但随着连续的割胶处理，只有HbPP2-B1.1和HbPP2-A13.2的表达水平在不断升高，HbPP2-B1和HbPP2-B10.1基本上保持着相似的表达趋势。另外HbPP2-B13和HbPP2-A15.1也在胶乳中特异表达，且HbPP2-B13的表达受割胶诱导。

鉴于转录组分析结果中HbPP2在橡胶树不同组织割胶处理中均有显著的表达差异，本研究选择了6个表达趋势较为显著的HbPP2家族成员基因设计引物，以橡胶树不同组织（胶乳、叶片、树皮、花和茎）与不同割次（1、3、5、9）处理的胶乳RNA为模板进行反转录，以反转录的cDNA为模板进行RT-qPCR分析，验证转录组数据。结果如图6、7所示，HbPP2-A13.2、HbPP2-B13、HbPP2-B1.1和HbPP2-B10.1和HbPP2-A14.1在不同组织中的表达趋势与转录组数据高度一致，虽然HbPP2-A15.1在不同组织中的表达趋势与转录组数据不完全一致，但整体的表达趋势一致。HbPP2-A13.2、HbPP2-B13和HbPP2-B1.1在不同割胶处理下均有1个上调表达的趋势，HbPP2-B10.1、HbPP2-A15.1和HbPP2-A14.1的表达趋势与转录组数据不完全一致，但在不同割胶处理下依旧无显著变化。综上所述，RT-qPCR实验结果验证了转录组数据的准确性。

3　讨论

收起

近年来，随着橡胶树基因组的测定，橡胶树基因家族的研究也得到了迅速发展，然而对橡胶树PP2基因家族的研究尚未见报道。早期的研究表明，葫芦属中PP2是一个小家族，包含2~8个基因^[18]，而WANG等^[31]认为PP2蛋白是由较多基因家族成员编码。本研究中，在拟南芥数据库中共搜索到30个PP2基因，木薯中搜索到19个PP2基因，橡胶树基因组共鉴定到17个PP2基因，相比较拟南芥而言，数量差异较大，这表明不同物种之间PP2数量差异明显，可能预示PP2基因随着物种演化发生独立进化。基于拟南芥PP2结构聚类分析显示该家族分为3个亚组，橡胶树PP2成员只分布在2个亚组中，在橡胶树中缺失拟南芥AtPP2-A1~AtPP2-A10 10个同源基因，且木薯的PP2基因在I亚组中仅有4个，进一步预示大戟科植物在进化过程中该亚组中的基因发生了变化。另外，根据已有的研究结果以及橡胶树HbPP2在I亚组的缺失现象^[20,32-33]，推测橡胶树中响应生物/非生物胁迫的功能在亚组之间出现了分化。

本研究对橡胶树基因组鉴定到的17个HbPP2基因进行生物信息学分析，发现橡胶树PP2家族成员编码的蛋白中无规则卷曲和延伸链占比较大，而无规则卷曲一般与酶活性和特异性功能的形成有关^[34]，这表明HbPP2基因可能进化出不一样的功能。拟南芥AtPP2 II亚群蛋白通过F-box结构域与其他蛋白结合从而参与调控许多重要的生物学过程^[19,35]。在橡胶树中，11个HbPP2蛋白中含有F-box结构域，其中HbPP2-A13.2在胶乳中特异性表达并受割胶诱导，表明含有F-box结构域的HbPP2-A13.2蛋白在割胶过程中发挥作用。HbPP2-B13虽然不包含F-box结构域，但在割胶过程中随着割胶刀次的增加其表达逐渐增强。同样HbPP2-B10.1和HbPP2-B1在胶乳中特异性表达，在割胶过程中保持一个较高的表达水平，这些蛋白是否具有类似F-box泛素连接酶的作用通过介导其他蛋白的稳定性或发挥凝集素作用来应答割胶刺激而参与橡胶树胶乳合成还需进一步探究。顺式作用元件及表达模式分析结果表明，在胶乳中特异表达的HbPP2-A13.2和HbPP2-B13蛋白含有多个激素诱导元件和抗性应答元件并在割胶过程中表达水平逐渐增强，推测HbPP2-A13.2和HbPP2-B13蛋白可能与激素受体蛋白或响应胁迫相关蛋白形成复合蛋白继而参与植物激素传导和应答生物/非生物胁迫。HbPP2-B10.1在种子中也表现出较高表达丰度，可能在合成并储存营养物质上同样发挥作用^[35-36]。HbPP2-B10、HbPP2-B15和HbPP2-B15.1在发育组织叶片和茎中表现出较高表达水平并含有大量光响应元件和分生组织表达调控元件，且不受割胶刺激的影响，推测这3个基因可能在植物生长、维持形态和光合作用物质输送方面发挥重要作用。HbPP2-A12、HbPP2-A13和HbPP2-A13.1在树皮中表现较高表达水平，但不受割胶诱导，说明这3个基因可能只参与了树皮的生长发育过程。HbPP2-A15.1不仅在胶乳中也在树皮中表现出较高的表达水平，在割胶过程中也出现1个上调的趋势，说明该基因在割胶伤害过程中会启动应答机制。综上，不同HbPP2基因家族在不同组织中的表达水平出现明显的差异，表明橡胶树HbPP2基因家族在组织表达特异性及功能特异性上具有分化差异。

本研究首次从巴西橡胶树中鉴定出HbPP2基因，并从基因家族成员鉴定、基因结构、顺式作用元件和表达模式等方面对HbPP2家族成员进行全面分析，对不同组织和不同割胶刀次胶乳中HbPP2家族成员表达模式进行分析，从中筛选出胶乳特异表达的HbPP2基因。本研究为进一步探索PP2基因家族在橡胶树胶乳合成代谢调控中的功能提供了理论基础。

基金

收起

六盘水师范学院科研培育项目(LPSSY2023KJZDPY07)
六盘水师范学院科研项目(LPSSYLPY202226)
海南省自然科学基金创新团队项目(322CXTD526)

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2025年第46卷第4期

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文章信息

doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2025.04.001

接收时间：2024-01-16
首发时间：2026-06-24
出版时间：2025-04-25

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收稿日期：2024-01-16
录用日期：2024-03-08

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六盘水师范学院科研培育项目(LPSSY2023KJZDPY07)

六盘水师范学院科研项目(LPSSYLPY202226)

海南省自然科学基金创新团队项目(322CXTD526)

作者信息

^1.大连大学生命健康学院，辽宁大连　116622

^2.六盘水师范学院生物科学与技术学院，贵州六盘水　553004

^3.中国热带农业科学院橡胶研究所/农业农村部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室，海南海口　571101

通讯作者:

^* 刘林娅（LIU Linya），E-mail：liulinya913@126.com

龙翔宇（LONG Xiangyu），E-mail：yuxianglong006@163.com。

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/rdzwxb/CN/10.3969/j.issn.1000-2561.2025.04.001

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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TxT

引物名称Primer name	引物序列（5′-3′）Primer sequence (5′-3′)
HbPP2-A13.2-F	TGGACAATCCTGGGAACTGG
HbPP2-A13.2-R	TGTGCTCATCTCACTGCCTA
HbPP2-B13-F	TGACAACAGCAGCTTATGG
HbPP2-B13-R	CAATCTCCAGCCACCCATC
HbPP2-B1.1-F	GCTGAAGGTTGTAAGCGAAGTT
HbPP2-B1.1-R	GTGGCGGAATAACCCGACTT
HbPP2-B10.1-F	GAACTGGTTGGAGGCGTGAA
HbPP2-B10.1-R	TTCCGTTTTCGGTCTCATCTCT
HbPP2A15.1-F	TGACGCCACCAGAGATTTGT
HbPP2A15.1-R	CCATCGTCAAATGGAACGGGA
HbPP2A14.1-F	GTGGAGGTCCTTCTCCATCAA
HbPP2A14.1-R	CGTCTCCCACACAAAATCGG

引物名称Primer name

引物序列（5′-3′）Primer sequence (5′-3′)

HbPP2-A13.2-F

TGGACAATCCTGGGAACTGG

HbPP2-A13.2-R

TGTGCTCATCTCACTGCCTA

HbPP2-B13-F

TGACAACAGCAGCTTATGG

HbPP2-B13-R

CAATCTCCAGCCACCCATC

HbPP2-B1.1-F

GCTGAAGGTTGTAAGCGAAGTT

HbPP2-B1.1-R

GTGGCGGAATAACCCGACTT

HbPP2-B10.1-F

GAACTGGTTGGAGGCGTGAA

HbPP2-B10.1-R

TTCCGTTTTCGGTCTCATCTCT

HbPP2A15.1-F

TGACGCCACCAGAGATTTGT

HbPP2A15.1-R

CCATCGTCAAATGGAACGGGA

HbPP2A14.1-F

GTGGAGGTCCTTCTCCATCAA

HbPP2A14.1-R

CGTCTCCCACACAAAATCGG

蛋白Protien	基因ID Gene ID	氨基酸个数Number of amino acids	分子质量Molecular weight/kDa	等电点pI	不稳定系数Instability index	亲水系数GRAVY
HbPP2-B1	scaffold0016_1581782	198	22.829	5.48	36.08	-0.608
HbPP2-A15	scaffold0020_30195	296	33.407	6.25	49.35	-0.313
HbPP2-A12	scaffold0082_457438	172	19.697	7.62	31.82	-0.178
HbPP2-A14	scaffold0148_1285467	285	32.384	6.65	50.70	-0.284
HbPP2-B13	scaffold0178_461591	140	15.530	9.64	48.08	-0.500
HbPP2-B15	scaffold0340_117358	538	61.206	7.03	47.91	-0.456
HbPP2-B15.1	scaffold0340_123434	231	26.018	5.37	46.87	-0.324
HbPP2-A13	scaffold0425_531538	290	32.903	6.20	46.35	-0.373
HbPP2-A13.1	scaffold0425_534088	290	32.958	6.36	47.87	-0.386
HbPP2-B10	scaffold0429_412565	170	19.614	7.83	47.37	-0.245
HbPP2-B10.1	scaffold0594_96082	201	23.027	5.54	40.93	-0.297
HbPP2-A15.1	scaffold0753_521075	294	33.394	5.94	55.04	-0.370
HbPP2-A13.2	scaffold0782_510591	290	32.886	6.38	35.09	-0.273
HbPP2-A12.1	scaffold0976_68746	295	33.524	9.06	41.26	-0.265
HbPP2-A14.1	scaffold0997_310741	285	32.328	7.99	51.38	-0.248
HbPP2-B11	scaffold1141_68043	83	9.402	8.74	35.23	0.206
HbPP2-B1.1	scaffold1150_191714	335	37.344	5.14	42.82	-0.444

蛋白Protien

基因ID Gene ID

氨基酸个数Number of amino acids

分子质量Molecular weight/kDa

等电点pI

不稳定系数Instability index

亲水系数GRAVY

HbPP2-B1

scaffold0016_1581782

198

22.829

5.48

36.08

-0.608

HbPP2-A15

scaffold0020_30195

296

33.407

6.25

49.35

-0.313

HbPP2-A12

scaffold0082_457438

172

19.697

7.62

31.82

-0.178

HbPP2-A14

scaffold0148_1285467

285

32.384

6.65

50.70

-0.284

HbPP2-B13

scaffold0178_461591

140

15.530

9.64

48.08

-0.500

HbPP2-B15

scaffold0340_117358

538

61.206

7.03

47.91

-0.456

HbPP2-B15.1

scaffold0340_123434

231

26.018

5.37

46.87

-0.324

HbPP2-A13

scaffold0425_531538

290

32.903

6.20

46.35

-0.373

HbPP2-A13.1

scaffold0425_534088

290

32.958

6.36

47.87

-0.386

HbPP2-B10

scaffold0429_412565

170

19.614

7.83

47.37

-0.245

HbPP2-B10.1

scaffold0594_96082

201

23.027

5.54

40.93

-0.297

HbPP2-A15.1

scaffold0753_521075

294

33.394

5.94

55.04

-0.370

HbPP2-A13.2

scaffold0782_510591

290

32.886

6.38

35.09

-0.273

HbPP2-A12.1

scaffold0976_68746

295

33.524

9.06

41.26

-0.265

HbPP2-A14.1

scaffold0997_310741

285

32.328

7.99

51.38

-0.248

HbPP2-B11

scaffold1141_68043

9.402

8.74

35.23

0.206

HbPP2-B1.1

scaffold1150_191714

335

37.344

5.14

42.82

-0.444

蛋白Protien	亚细胞定位Subcellular localization	α-螺旋Alpha helix/%	β-转角Beta turn/%	延伸链Extended strand/%	无规则卷曲Random coil/%
HbPP2-B1	Chloroplast, Cytoplasm	12.63	5.05	27.78	54.55
HbPP2-A15	Cell membrane, Chloroplast	25.34	7.09	27.03	40.54
HbPP2-A12	Cell membrane, Chloroplast	16.28	9.88	38.37	35.47
HbPP2-A14	Chloroplast	26.67	7.02	24.21	42.11
HbPP2-B13	Chloroplast	10.71	7.14	22.86	59.29
HbPP2-B15	Nucleus	28.44	4.65	23.42	43.49
HbPP2-B15.1	Nucleus	27.27	4.33	21.65	46.75
HbPP2-A13	Chloroplast	22.76	5.17	28.28	43.79
HbPP2-A13.1	Chloroplast	23.45	5.86	26.21	44.48
HbPP2-B10	Chloroplast	14.71	4.71	29.41	51.18
HbPP2-B10.1	Cytoplasmic	9.95	8.46	35.32	46.27
HbPP2-A15.1	Nuclear	25.17	6.80	25.85	42.18
HbPP2-A13.2	Nuclear	22.07	6.21	26.55	45.17
HbPP2-A12.1	Cytoplasmic	24.75	4.75	25.08	45.42
HbPP2-A14.1	Nuclear	22.81	6.32	28.77	42.11
HbPP2-B11	Cytoplasmic	16.87	7.23	42.17	33.73
HbPP2-B1.1	Nuclear	22.39	5.67	23.88	48.06

蛋白Protien

亚细胞定位Subcellular localization

α-螺旋Alpha helix/%

β-转角Beta turn/%

延伸链Extended strand/%

无规则卷曲Random coil/%

HbPP2-B1

Chloroplast, Cytoplasm

12.63

5.05

27.78

54.55

HbPP2-A15

Cell membrane, Chloroplast

25.34

7.09

27.03

40.54

HbPP2-A12

Cell membrane, Chloroplast

16.28

9.88

38.37

35.47

HbPP2-A14

Chloroplast

26.67

7.02

24.21

42.11

HbPP2-B13

Chloroplast

10.71

7.14

22.86

59.29

HbPP2-B15

Nucleus

28.44

4.65

23.42

43.49

HbPP2-B15.1

Nucleus

27.27

4.33

21.65

46.75

HbPP2-A13

Chloroplast

22.76

5.17

28.28

43.79

HbPP2-A13.1

Chloroplast

23.45

5.86

26.21

44.48

HbPP2-B10

Chloroplast

14.71

4.71

29.41

51.18

HbPP2-B10.1

Cytoplasmic

9.95

8.46

35.32

46.27

HbPP2-A15.1

Nuclear

25.17

6.80

25.85

42.18

HbPP2-A13.2

Nuclear

22.07

6.21

26.55

45.17

HbPP2-A12.1

Cytoplasmic

24.75

4.75

25.08

45.42

HbPP2-A14.1

Nuclear

22.81

6.32

28.77

42.11

HbPP2-B11

Cytoplasmic

16.87

7.23

42.17

33.73

HbPP2-B1.1

Nuclear

22.39

5.67

23.88

48.06