热带作物学报

橡胶树硫氧还蛋白基因HbTRXo2克隆、表达及功能分析

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杨娜 ¹^,² , 吴双 ¹^,³ , 逯锐琳 ¹ , 何其光 ¹ , 胡义钰 ¹ , 朱春梅 ² , 王真辉 ¹ , 刘辉 ¹^,^*

热带作物学报 | 组学与生物技术 2024,45(10): 1999-2009

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热带作物学报 |组学与生物技术 2024 , 45 (10) : 1999 -2009

橡胶树硫氧还蛋白基因HbTRXo2克隆、表达及功能分析

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杨娜¹^,², 吴双¹^,³, 逯锐琳¹, 何其光¹, 胡义钰¹, 朱春梅², 王真辉¹, 刘辉¹^,^*

作者信息

^1.中国热带农业科学院橡胶研究所/农业农村部橡胶树生物学与遗传资源利用重点实验室/省部共建国家重点实验室培育基地-海南省热带作物栽培生理学重点实验室，海南海口　571101

^2.云南农业大学热带作物学院，云南普洱　665099

^3.海南大学热带农林学院，海南海口　570228

通讯作者:

^* 刘辉（LIU Hui），E-mail：liuhui@catas.cn。

Cloning, Expression and Functional Analysis of the Thioredoxin Gene HbTRXo2 in Hevea brasiliensis

Na YANG¹^,², Shuang WU¹^,³, Ruilin LU¹, Qiguang HE¹, Yiyu HU¹, Chunmei ZHU², Zhenhui WANG¹, Hui LIU¹^,^*

Affiliations

^1.Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree, Ministry of Agriculture and Rural Affairs / State Key Laboratory Incubation Base for Cultivation & Physiology of Tropical Crops, Haikou, Hainan 571101, China

^2.College of Tropical Crops, Yunnan Agricultural University, Pu’er, Yunnan 665099, China

^3.School of Tropical Agriculture and Forestry, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China

出版时间: 2024-10-25 doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2024.10.001

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摘要

收起

硫氧还蛋白（thioredoxin，TRX）作为氧化还原调节蛋白在植物抵御非生物逆境胁迫中发挥重要作用。本研究采用RT-PCR从橡胶树（Hevea brasiliensis）中克隆了硫氧还蛋白基因HbTRXo2，该基因编码区长594 bp，编码197个氨基酸。预测HbTRXo2蛋白的分子量为21.90 kDa，理论等电点为7.59。蛋白保守结构域和系统进化分析结果显示，HbTRXo2含有TRX保守结构域，与其他植物o型硫氧还蛋白聚在一起，表明该蛋白属于o型硫氧还蛋白。实时荧光定量PCR分析表明，HbTRXo2基因在橡胶树根、树皮、胶乳、成熟叶、衰老叶、新梢、雌花和雄花组织中均表达，其中在胶乳中的表达量显著高于其他组织。同健康橡胶树相比，割面干涸橡胶树树皮和胶乳中HbTRXo2的表达量显著降低。在低温、聚乙二醇（PEG）诱导的干旱以及过氧化氢（H₂O₂）和甲基紫精（MV）诱导的氧化胁迫处理下，HbTRXo2基因的表达显著上调，表明该基因参与了橡胶树对非生物胁迫的应答。为了研究HbTRXo2在抗逆中的功能，本研究构建其酵母表达载体，并转入酿酒酵母INVSc1菌株中，获得重组酵母INVSc1（pYES2-HbTRXo2）。比较重组酵母INVSc1（pYES2-HbTRXo2）和转空载体对照酵母INVSc1（pYES2）在H₂O₂、PEG和低温胁迫处理后的存活差异。结果显示，重组酵母INVSc1（pYES2-HbTRXo2）在PEG和H₂O₂处理后的存活率明显高于对照酵母，而在低温胁迫处理后的存活率明显低于对照酵母，表明转HbTRXo2基因提高了重组酵母对干旱和氧化胁迫的抗性，但降低了对低温胁迫的抗性。以上研究结果证明，HbTRXo2在橡胶树产排胶和抗逆过程中起着重要作用。本研究为进一步解析HbTRXo2在橡胶树中的生物学功能提供重要的参考依据。

关键词

硫氧还蛋白 / 橡胶树 / 基因表达 / 酵母表达 / 抗氧化性 / 非生物逆境胁迫

Abstract

收起

Thioredoxin (TRX), a redox regulatory protein, plays an important role in plant resistance to abiotic stress. In this study, HbTRXo2, a thioredoxin gene, was cloned from rubber tree (Hevea brasiliensis) using RT-PCR. HbTRXo2 contained a coding region of 594 bp encoding a protein of 197 amino acids. The predicted molecular weight and isoelectric point of HbTRXo2 was 21.90 kDa and 7.59, respectively. The conserved domain and phylogenetic analysis showed that HbTRXo2 had a conserved TRX domain and was clustered with other plant o-type thioredoxin, suggesting that HbTRXo2 belonged to o-type thioredoxin. Quantitative real-time PCR indicated that HbTRXo2 gene was expressed in root, bark, latex, mature leaf, senescent leaf, new shoot, female flower and male flower tissues of rubber tree, with significantly higher expression level in latex than in other tissues. Compared with the healthy rubber trees, the expression of HbTRXo2 in the bark and latex of tapping panel dryness trees was significantly reduced. Under cold, polyethylene glycol (PEG)-induced drought, and oxidative stress induced by hydrogen peroxide (H₂O₂) and methyl violet (MV), the expression of HbTRXo2 gene was significantly up-regulated, indicating the involvement of HbTRXo2 in response to abiotic stress in rubber tree. To explore the function of HbTRXo2 in stress resistance, its yeast expression vector was constructed and transferred into Saccharomyces cerevisiae INVSC1 to obtain the recombinant yeast INVSC1 (pYES2-HbTRXo2). The survival differences between the recombinant yeast INVSC1 (pYES2-HbTRXo2) and the control yeast INVSC1 (pYES2) transformed with pYES2 empty vector after H₂O₂, PEG, and low temperature stress treatments were compared, and the results showed that the survival rate of INVSc1 (pYES2-HbTRXo2) was significantly higher than that of INVSC1 (pYES2) after PEG and H₂O₂ treatments, while the survival rate of INVSc1 (pYES2-HbTRXo2) was significantly lower than that of INVSC1 (pYES2) after low temperature stress treatment, indicating that the recombinant yeast transformed with HbTRXo2 gene improved the resistance to drought and oxidative stresses, but decreased the resistance to low temperature stress. The results demonstrate that HbTRXo2 plays an important role in latex production and latex flow, as well as abiotic stress resistance in rubber tree. The study would provide important references for further elucidating the biological function of HbTRXo2 in rubber trees.

Key words

thioredoxin / rubber tree / gene expression / yeast expression / antioxidation / abiotic stress

引用本文

杨娜, 吴双, 逯锐琳, 何其光, 胡义钰, 朱春梅, 王真辉, 刘辉. 橡胶树硫氧还蛋白基因HbTRXo2克隆、表达及功能分析. 热带作物学报, 2024 , 45 (10) : 1999 -2009 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2024.10.001

Na YANG, Shuang WU, Ruilin LU, Qiguang HE, Yiyu HU, Chunmei ZHU, Zhenhui WANG, Hui LIU. Cloning, Expression and Functional Analysis of the Thioredoxin Gene HbTRXo2 in Hevea brasiliensis[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2024 , 45 (10) : 1999 -2009 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2024.10.001

正文

收起

硫氧还蛋白（thioredoxin，TRX）是生物体内广泛存在的一种高度保守、酸性、热稳定的小分子蛋白质^[1-3]。硫氧还蛋白含有保守的氧化还原活性位点，其核心序列通常为C（G/P）PC（Cys-Gly/Pro-Pro-Cys），极少数为C（G/P）PS（Trp-Cys-Gly/Pro-Pro-Ser）^[4-5]。硫氧还蛋白与硫氧还蛋白还原酶（thioredoxin reductase，TR）、还原型烟酰腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）一起构成硫氧还蛋白系统^[6-7]。硫氧还蛋白系统是机体重要的抗氧化系统，在清除活性氧、维持细胞内的氧化还原稳态平衡中发挥着重要作用^[6-8]。

植物硫氧还蛋白基因家族成员众多，如水稻（Oryza sativa）基因组中含有30个TRX基因^[9]，甜橙（Citrus sinensis）基因组中含有22个TRX基因^[10]。根据氨基酸序列差异，植物硫氧还蛋白家族基因被划分为7种类型：f、h、m、o、x、y和z^[1,11]。大多数植物仅含有1个o型TRX基因，如杨树和水稻。少数植物含有2个o型TRX基因，如拟南芥^[5]。拟南芥AtTRXo1已被证实定位于线粒体，而AtTRXo2的亚细胞定位目前仍不清楚^[12]。李宇佳^[13]研究发现，在拟南芥中超量表达AtTRXo1提高了转基因株系在盐胁迫下的发芽率，促进了转基因植株在盐胁迫下的生长。同野生型相比，盐胁迫下拟南芥AtTRXo1突变体种子发芽更快^[14]，植株叶片失水速率降低，气孔关闭增加，还原型抗坏血酸、H₂O₂、NO水平以及过氧化氢酶活性升高^[15-16]。此外，AtTRXo1通过与ABA受体PYR1（pyrabactin resistance 1）互作参与ABA信号调控^[17]。对豌豆o型TRX基因PsTRXo1的研究发现，在烟草BY-2细胞中超量表达PsTRXo1提高了过氧化氢酶活性以及自噬相关基因和蛋白的表达，降低了H₂O₂和NO含量，维持了谷胱甘肽的氧化还原状态，增强了转基因细胞对氧化胁迫的抗性^[18-19]。目前，对o型TRX基因的研究还不深入，除AtTRXo1和PsTRXo1外，未见有关其他植物o型TRX基因功能研究的报道。

橡胶树（Hevea brasiliensis）作为一种重要的热带经济林木，是重要工业原料天然橡胶的主要来源。我国橡胶树种植面积约113.33万hm²，分布在海南、云南和广东等地区，年产天然橡胶约80万t^[20]。低温、干旱和台风是影响我国橡胶树生长、发育和产量的3种主要气象灾害^[21]。此外，我国橡胶树割面干涸（tapping panel dryness，TPD，国内常称为死皮）发生率高，导致严重减产。为了探究o型TRX基因在橡胶树割面干涸和非生物胁迫应答中的作用，本研究克隆橡胶树HbTRXo2基因，分析其表达特性，并利用酵母表达系统鉴定该基因在非生物胁迫（氧化、低温和干旱）抗性中的功能。

1　材料与方法

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1.1　材料

本研究所用橡胶树品种为热研7-33-97。树皮、胶乳、成熟叶、衰老叶、新梢、雌花和雄花等组织样品采自中国热带农业科学院试验场六队种植的热研7-33-97健康植株（树龄16年）。同时，在相同树位，选择割线70%左右不排胶的割面干涸橡胶树，采集胶乳和树皮样品。根组织样品采自热研7-33-97组培苗。样品采集后液氮速冻，–80 ℃保存，用于总RNA提取。取移栽培养8个月的健康热研7-33-97组培苗用于各种非生物胁迫处理。

1.2　方法

1.2.1　非生物胁迫处理

低温（4 ℃）、聚乙二醇（PEG）诱导的干旱胁迫、甲基紫精（MV）和过氧化氢（H₂O₂）诱导的氧化胁迫处理参照李双江等^[22]的方法。PEG采用的是PEG6000，处理浓度为30%。MV和H₂O₂处理浓度分别为200 μmol/L、20 mmol/L。均在处理0、3、6、12、24、48 h时，采集叶片样品。每个处理3次生物学重复，每重复3株植株。样品采集后置于液氮速冻，–80 ℃保存，用于总RNA提取。

1.2.2　总RNA提取和反转录

采用植物通用提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）提取树皮、新梢、雄花、雌花、成熟叶、衰老叶和根的总RNA，采用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取胶乳总RNA。RNA经质量检测后，采用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（TaKaRa）反转录合成cDNA。具体操作方法参照相应试剂盒说明书。

1.2.3　 HbTRXo2基因的克隆

将拟南芥AtTRXo1基因序列（NM_129053.6）在橡胶树HeveaDB数据库（http://hevea.catas.cn/home/index）中进行比对，获得橡胶树的同源基因scaffold0032_ 237207，将其命名为HbTRXo2。根据scaffold0032_ 237207序列，利用Primer3web（https://bioinfo.ut.ee/primer3/）在线软件设计扩增完整编码区的引物，并在正、反向引物5'端分别加上Kpn I、Xba I酶切位点和保护碱基，以便于后续构建酵母表达载体。正向引物序列：5'-TAGGTACCGGTACGAC CGAAACTGCATC-3'，反向引物序列：5'-GCTCTA GATTAGTCCTTCCCATAGAGTTCTTC-3'。PCR扩增目标基因，反应体系：2.5 U/μL TransStart FastPfu DNA Polymerase 1 μL、5×TransStart FastPfu Buffer 10 μL、2.5 mmol/L dNTPs 4 μL、10 μmol/L正/反向引物各1.5 μL、胶乳cDNA 3 μL、ddH₂O 29 μL。扩增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 45 s，35个循环；72 ℃10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并采用Gel Extraction Kit（OMEGA）回收纯化目标片段。纯化片段连接到pEASY-Blunt Simple Cloning Vector（北京全式金生物技术有限公司），转化Trans1-T1 Phage Resistant大肠杆菌感受态细胞，挑取阳性单克隆送至海南楠山生物技术有限公司测序。

1.2.4　生物学信息分析

使用SoftBerry（http://linux1.softberry.com/）在线数据库中的FGENESH工具预测基因编码区及其编码的氨基酸序列；使用Compute pI/Mw（https://web.expasy.org/compute_pi/）在线软件分析蛋白的分子量和等电点；使用CDD（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）在线软件预测HbTRXo2蛋白的保守结构域；从NCBI数据下载其他植物的硫氧还蛋白序列，使用MEGA-X软件中的邻接法（neighbor-joining）构建系统进化树，bootstrap参数设置为1000^[23]。

1.2.5　实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析

利用在线工具Primer3web设计HbTRXo2的qRT-PCR特异引物，正向引物序列：5'-GCAGATG TTGGACGCTTGAA-3'，反向引物序列：5'-ACCC ACTGTCATTCCATCACT-3'）。内参基因使用HbUBC4（正向引物序列：5'-TCACCCTGAACCT GATAGCC-3'，反向引物序列：5'-TTTCTTTGG TGACGCTGCAA-3'）^[24]。qRT-PCR试剂采用TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus），反应体系和反应条件参照试剂说明书，检测采用CFX96型荧光定量PCR仪（Bio-Rad）。基因相对表达量的计算采用2^-ΔΔC_T法^[25]。采用WPS office软件进行数据处理与制图，使用SAS 8.1软件分析差异显著性（P<0.05）。

1.2.6　转HbTRXo2基因酵母

使用Plasmid Mini Kit I（OMEGA）提取上述测序正确单克隆和酵母表达载体pYES2的质粒，进行Kpn I和Xba I双酶切。1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，采用Gel Extraction Kit（OMEGA）回收纯化目标片段。使用T₄ DNA连接酶（Thermo Scientific）将回收的HbTRXo2基因与pYES2载体连接，获得重组载体pYES2-HbTRXo2。采用热激法将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，并涂于含氨苄青霉素100 mg/L的LB固体平板上，37 ℃培养过夜。选取单克隆进行菌落PCR检测，引物采用pYES2载体正向引物（5'-CCCGGATCGGACTACTAGC-3'）和扩增HbTRXo2基因的反向引物。使用Plasmid Mini Kit I（OMEGA）提取PCP检测正确单克隆的质粒，参照pYES2载体说明书（Invitrogen）制备酿酒酵母菌株INVSc1感受态细胞。采用醋酸锂转化法将pYES2-HbTRXo2和pYES2载体质粒分别转入感受态细胞中，并涂于SC-Ura固体选择培养基[DO Supplement-Ura（Clontech）0.78 g/L、无氨基酵母氮源6.7 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂粉20 g/L]上，30 ℃倒置培养3 d。选取3个单克隆摇菌，采用酵母质粒提取试剂盒（OMEGA）提取质粒。采用pYES2载体正向引物加HbTRXo2基因反向引物或pYES2载体反向引物（5'-ATTAAAGCCTTCGAGCGTCC-3'）进行PCR检测，获得重组酵母INVSc1（pYES2-HbTRXo2）和对照酵母INVSc1（pYES2）。

1.2.7　重组酵母中HbTRXo2的表达检测

将获得的重组酵母INVSc1（pYES2-HbTRXo2）和对照酵母INVSc1（pYES2）划线于SC-Ura固体选择培养基上，30 ℃倒置培养2 d。挑单克隆接种于2 mL SC-Ura液体选择培养基中，30 ℃、200 r/min振荡培养24 h，测量其OD₆₀₀值。取一定量的培养液，离心收集菌体，然后用SC-Ura液体诱导培养基[DO Supplement-Ura（Clontech）0.78 g/L、无氨基酵母氮源6.7 g/L、半乳糖20 g/L]重悬菌体，并调整OD₆₀₀=0.2。取10 mL，30 ℃，200 r/min诱导培养24 h。参照酵母总RNA快速提取试剂盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]提取重组酵母和对照酵母总RNA。使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）（TaKaRa）反转录合成cDNA。以酿酒酵母Actin基因（正向引物序列：5′-AGTTGCCCCAGAAGAA CACC-3′；反向引物序列：5′-TACCGGCAGATTC CAAACCC-3′）作为内参基因确定每个模板cDNA的加入量，再使用HbTRXo2基因引物对模板进行PCR扩增。PCR反应体系为：EasyTaq DNA Polymerase（北京全式金生物技术有限公司）0.5 μL、Buffer 2.5 μL、dNTPs 2 μL、正/反向引物各0.5 μL、cDNA模板1~3 μL，补ddH₂O至总体积25 μL。反应程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。取10 μL PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.8　非生物胁迫处理

取重组酵母INVSc1（pYES2-HbTRXo2）和对照酵母INVSc1（pYES2）划线培养的单克隆，参照上述1.2.7中的方法先选择培养24 h再诱导培养24 h。取一定量的培养液，离心收集菌体，然后用无菌水重悬菌体，并调整OD₆₀₀=2.0。氧化胁迫处理组：取调整好的菌液0.5 mL，加入20 mmol/L或30 mmol/L的H₂O₂溶液0.5 mL混匀；干旱胁迫处理组：取菌液0.5 mL，4000 r/min离心2 min，去上清液0.25 mL后加入40%的PEG6000溶液0.75 mL混匀；将以上各处理组置于30 ℃、160 r/min摇床中处理。低温处理组：取菌液0.5 mL，加入0.5 mL无菌水，混匀后置于–20 ℃冰箱中。每12 h取出解冻后再放入–20 ℃冰箱中处理。氧化胁迫处理0（对照）和1 d，干旱和低温处理0（对照）、5、7 d，用无菌水将处理后的菌液进行5倍的梯度稀释。取不同稀释倍数的菌液各5 μL分别点样在SC-Ura固体选择培养基上，每处理3次重复。30 ℃倒置培养3 d，观察比较菌落的生长差异。

2　结果与分析

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2.1　 HbTRXo2基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR从橡胶树胶乳中克隆了HbTRXo2基因，测序结果显示，克隆片段的大小为683 bp。基因预测表明，HbTRXo2基因编码区长度为594 bp，编码197个氨基酸。蛋白理化性质预测表明，HbTRXo2蛋白的分子量为21.90 kDa，理论等电点为7.59。保守结构域分析显示（图1），HbTRXo2蛋白含有TRX保守结构域（pfam00085），位于第88~192位氨基酸，其氧化还原活性位点核心序列为CGPC，位于第119~122位氨基酸，表明该蛋白属于硫氧还蛋白家族的成员。

2.2　HbTRXo2蛋白的系统进化分析

从NCBI数据库下载不同类型的植物硫氧还蛋白，与HbTRXo2蛋白一起构建系统进化树，结果如图2所示。这些硫氧还蛋白可分为7类：m、f、h、o、x、y和z。HbTRXo2与其他植物o型硫氧还蛋白聚在一类，故其属于o型硫氧还蛋白。o型硫氧还蛋白又分为2个亚组：Ⅰ和Ⅱ。亚组Ⅰ为单子叶植物的o型硫氧还蛋白，包括水稻OsTRXo1、玉米ZmTRXo1和小麦TaTRXo；亚组Ⅱ为双子叶植物的o型硫氧还蛋白，包括橡胶树HbTRXo2、木薯MeTRXo2、麻风树JcTRXo1、蓖麻RcTRXo2、拟南芥AtTRXo1和AtTRXo2、葡萄VvTRXo1和VvTRXo2。HbTRXo2与木薯MeTRXo2近缘关系最近，氨基酸序列一致性为83%，其次是麻风树JcTRXo1和蓖麻RcTRXo2，氨基酸序列一致性分别为70%和65%。

2.3　 HbTRXo2基因的组织表达特性

采用qRT-PCR检测HbTRXo2基因在橡胶树各组织中的表达特性，结果如图3所示。HbTRXo2基因在橡胶树根、树皮、胶乳、成熟叶、衰老叶、新梢、雌花和雄花中均表达，但表达量存在显著差异。胶乳中HbTRXo2基因的表达量最高，显著高于其他组织；成熟叶与树皮中的表达量次之，约为胶乳中表达量的1/3；新梢中的表达量最低，不足胶乳的1/10。同健康橡胶树相比，割面干涸橡胶树树皮和胶乳中HbTRXo2基因的表达显著降低（图4）。

2.4　 HbTRXo2的表达受非生物逆境胁迫诱导

采用qRT-PCR检测HbTRXo2基因在低温、干旱以及氧化胁迫下的表达变化，结果如图5所示。低温胁迫处理显著上调了HbTRXo2基因的表达，在处理3、12、24、48 h时，HbTRXo2的表达约为处理前的1.6倍。PEG诱导的干旱胁迫处理也上调了HbTRXo2基因的表达，在处理3、6、24、48 h时，HbTRXo2的表达显著高于处理前。其中，处理48 h时HbTRXo2的表达量最高，为处理前的4.4倍。在H₂O₂和MV诱导的氧化胁迫下，HbTRXo2基因的表达变化趋势相似，均呈先升高后下降趋势。在处理6 h时，表达量升高至最大值，此后逐渐下降，在处理48 h时，基本下降至正常水平。以上结果表明，HbTRXo2基因的表达受低温、干旱和氧化胁迫的诱导。

2.5　 HbTRXo2基因在抗逆中的功能鉴定

2.5.1　转HbTRXo2基因酵母的分子检测

通过酶切连接的方法构建HbTRXo2基因的酵母表达载体pYES2-HbTRXo2。采用醋酸锂转化法将空载体pYES2和pYES2-HbTRXo2质粒分别转入酿酒酵母菌株INVSc1。挑取对照酵母INVSc1（pYES2）和重组酵母INVSc1（pYES2-HbTRXo2）单克隆各3个，抽提质粒DNA，经PCR检测，3个转空载体pYES2的对照酵母质粒DNA扩增出与阳性对照（pYES2质粒DNA）大小一致的条带，且符合预期长度（图6A），3个转pYES2-HbTRXo2的重组酵母质粒DNA扩增出与阳性对照（pYES2-HbTRXo2质粒DNA）大小一致的条带，且符合预期长度（图6B）。以上结果表明，空载体pYES2和pYES2-HbTRXo2成功转入对照酵母INVSc1（pYES2）和重组酵母INVSc1（pYES2-HbTRXo2）。

为明确HbTRXo2基因是否在重组酵母中表达，采用半定量RT-PCR检测HbTRXo2基因在重组酵母INVSc1（pYES2-HbTRXo2）和对照酵母INVSc1（pYES2）中的表达情况。如图7所示，经半乳糖诱导24 h后，重组酵母INVSc1（pYES2-HbTRXo2）中可检测到外源基因HbTRXo2的表达，而对照酵母INVSc1（pYES2）中检测不到外源基因HbTRXo2的表达，这表明HbTRXo2基因转入酵母并成功表达。

2.5.2　表达HbTRXo2提高了重组酵母的抗氧化性

为明确HbTRXo2基因在氧化胁迫应答中的作用，比较了重组酵母INVSc1（pYES2-HbTRXo2）和对照酵母INVSc1（pYES2）在0、10、20 mmol/L H₂O₂处理20 h后的存活差异，结果如图8所示。对照组（无H₂O₂处理，CK）中，各梯度稀释浓度下重组酵母和对照酵母生长状况基本一致，菌斑数无明显差异，表明酵母中表达HbTRXo2基因对其正常生长无明显影响。同对照组相比，H₂O₂处理组中酵母菌斑数明显减少，表明H₂O₂处理导致酵母细胞死亡。10、20 mmol/L H₂O₂处理组中，各梯度稀释下重组酵母的菌斑数显著多于对照酵母，这表明转HbTRXo2基因酵母在H₂O₂诱导的氧化胁迫下的死亡率降低，表达HbTRXo2提高了重组酵母对氧化胁迫的抗性。

2.5.3　表达HbTRXo2提高了重组酵母的抗旱性

比较重组酵母INVSc1（pYES2-HbTRXo2）和对照酵母INVSc1（pYES2）在PEG诱导的干旱胁迫处理后的存活差异，结果如图9所示。对照组中，各梯度稀释浓度下重组酵母与对照酵母的生长状况基本一致，无明显差异。30% PEG处理诱导了酵母细胞死亡，但在处理5 d和7 d中，重组酵母在5^-2、5^-3、5^-4稀释下的菌斑数明显多于对照酵母。以上结果表明，转HbTRXo2基因酵母在PEG诱导的干旱胁迫下的死亡率降低，表达HbTRXo2提高了重组酵母对干旱胁迫的抗性。

2.5.4　表达HbTRXo2降低了重组酵母的抗寒性

比较重组酵母INVSc1（pYES2-HbTRXo2）和对照酵母INVSc1（pYES2）在低温胁迫处理后的存活差异，结果如图10所示。对照组中，各梯度稀释浓度下重组酵母与对照酵母的生长状况基本一致，无明显差异。–20 ℃处理5 d，重组酵母在5^–1、5^–2、5^–3稀释下的菌斑数明显少于对照酵母。处理7 d时，在无稀释条件下，重组酵母的菌斑数量明显少于对照酵母；在浓度为5^–1时，对照酵母仍有少量菌斑生长，而重组酵母无菌斑生长。以上结果表明，转HbTRXo2基因酵母在低温胁迫下的死亡率增加，表达HbTRXo2降低了重组酵母的抗寒性。

3　讨论

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硫氧还蛋白是植物体内一类重要的氧化还原调控蛋白，在植物生长发育、生物与非生物逆境胁迫响应中发挥重要作用^[1,8,11,26]。植物硫氧还蛋白被分为f、h、m、o、x、y和z等7种类型^[1,11]，广泛分布于几乎所有的亚细胞区室中。其中，o型硫氧还蛋白主要存在于线粒体和细胞核中，f、m、x、y和z型硫氧还蛋白主要分布于叶绿体中，而h型硫氧还蛋白广泛分布于细胞质、细胞核、内质网和线粒体等中^[11,26-27]。目前，对于细胞质和叶绿体硫氧还蛋白系统的研究较为深入，但对于线粒体硫氧还蛋白系统的研究较少^[16,27-28]。o型硫氧还蛋白作为最主要的线粒体硫氧还蛋白，对其进行深入研究将有助于增强对线粒体硫氧还蛋白系统的认识。本研究从橡胶树中克隆的HbTRXo2基因编码的蛋白含有TRX保守结构域（pfam00085），其氧化还原活性位点核心序列为CGPC，与其他植物o型硫氧还蛋白聚在一类，说明其属于o型硫氧还蛋白。

ORTIZ-ESPÍN等^[14]研究发现，拟南芥o型硫氧还蛋白基因AtTRXo1在根、茎、叶、花以及不同发育阶段的角果中均有表达，但不同组织中的表达存在一定差异。为了解HbTRXo2基因的组织表达特性，本研究检测了该基因在橡胶树根、树皮、胶乳、成熟叶、衰老叶、新梢、雌花和雄花等组织中的表达，发现HbTRXo2在各组织中均表达，但不同组织间存在明显差异。HbTRXo2在胶乳中的表达量显著高于其他组织，且在产量显著降低的割面干涸植株胶乳中的表达显著降低，这与本课题组前期克隆的橡胶树h型硫氧还蛋白基因HbCXXS1的表达相似^[29]，HbTRXo2和HbCXXS1等硫氧还蛋白基因可能在维持橡胶树乳管系统的氧化还原稳态平衡中发挥重要作用。杨洪等^[30]通过比较健康树和不同程度割面干涸橡胶树树皮线粒体超微结构及活性氧代谢相关基因表达差异认为，线粒体等细胞器氧化损伤是橡胶树割面干涸发生的关键过程。本研究发现，HbTRXo2在割面干涸橡胶树中的表达显著降低，而酵母中超量表达HbTRXo2能提高对氧化胁迫的抗性。据此，推测HbTRXo2基因表达的降低导致细胞内氧化还原稳态失衡，活性氧过量积累损伤线粒体，进而导致橡胶树割面干涸的发生。HbTRXo2基因可能通过调节抗氧化性在橡胶树割面干涸发生过程中起着重要作用，增强HbTRXo2基因的表达或许能降低橡胶树割面干涸的发生。

硫氧还蛋白在植物抵御非生物逆境胁迫过程中发挥着重要的生物学功能^[1,26]。荆晓姝等^[31]研究发现，在烟草中超量表达秋茄（Kandelia candel）f型硫氧还蛋白基因KcTrxf能提高转基因植株对盐胁迫的抗性。对中国野生葡萄—燕山葡萄（Vitis yeshanesis Yanshan）y型硫氧还蛋白基因VyTRXy的研究表明，在本氏烟草（Nicotiana benthamiana）中超量表达VyTRXy可以提高转基因植株的抗旱性^[32]。对拟南芥和豌豆o型氧还蛋白基因AtTRXo1和PsTRXo1的研究证实，o型氧还蛋白基因也参与了非生物逆境胁迫应答^{[13-14,18-19]}。拟南芥中超量表达AtTRXo1能提高抗盐性^[13]，而在烟草BY-2细胞中超量表达PsTRXo1能增强转基因细胞的抗氧化性^[18-19]。本研究发现，在低温、干旱和氧化胁迫下橡胶树HbTRXo2基因的表达显著上调，表明该基因参与非生物逆境胁迫应答。为鉴定该基因在非生物逆境胁迫中的功能，本研究构建HbTRXo2基因的酵母表达载体，并将其转入了酿酒酵母。对转基因酵母进行H₂O₂诱导的氧化胁迫、PEG诱导的干旱胁迫和低温胁迫处理发现，转HbTRXo2基因提高了重组酵母对氧化和干旱胁迫的抗性，但却降低了对低温的抗性。据此推测，HbTRXo2基因可用于橡胶树非生物逆境胁迫抗性遗传改良，通过基因工程手段在橡胶树中超量表达该基因可能提高植株的抗旱性，而敲除或抑制该基因的表达可能提高植株的抗寒性，后续还需在橡胶树体内进一步验证该推测是否正确。由于HbTRXo2基因在干旱和低温应答中的功能截然不同，这可能会制约该基因的利用。因为在改善一种抗性的同时可能会对另一种抗性产生不利影响。造成HbTRXo2基因在干旱和低温应答中的功能差异以及如何合理利用该基因用于橡胶树非生物逆境胁迫改良仍需进一步深入研究。

基金

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国家自然科学基金面上项目(32371922)
中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(1630022023008)

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2024年第45卷第10期

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doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2024.10.001

接收时间：2024-03-27
首发时间：2026-06-25
出版时间：2024-10-25

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收稿日期：2024-03-27
修回日期：2024-04-02

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作者信息

^2.云南农业大学热带作物学院，云南普洱　665099

^3.海南大学热带农林学院，海南海口　570228

通讯作者:

^* 刘辉（LIU Hui），E-mail：liuhui@catas.cn。

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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