热带作物学报

病叶级数Diseased leaf series	判断标准Judgement standard
0	无病斑
1	病斑面积占整个叶片面积的5%以下
3	病斑面积占整个叶片面积的6%~10%
5	病斑面积占整个叶片面积的11%~20%
7	病斑面积占整个叶片面积的21%~50%
9	病斑面积占整个叶片面积的51%以上

病叶级数Diseased leaf series	判断标准Judgement standard
0	无病斑
1	病斑面积占整个叶片面积的5%以下
3	病斑面积占整个叶片面积的6%~10%
5	病斑面积占整个叶片面积的11%~20%
7	病斑面积占整个叶片面积的21%~50%
9	病斑面积占整个叶片面积的51%以上

NCBI编号NCBI No.	引物序列（5ʹ–3ʹ）Primer sequence (5ʹ–3ʹ)	基因及其描述Genes and their descriptions
LOC111021666	F: CCCTCCCTCATGCAATTCTC	actin-7-like，肌动蛋白
	R: TCGGCAGTAGTGGTAAACATGTAAC
LOC111018837	F: GCCTGAAGTAGGCACTCCTG	linoleate 9S-lipoxygenase 6-like，脂氧合酶，JA反应标记性基因
	R: GTCCACTCAATGCTGGCTCT
LOC111017362	F: CAACACAAATCACCGCCGAC	pathogenesis-related protein PR-1 type-like，SA反应标记性基因
	R: ACCAGAAACCCCAAGTGCTC
LOC111021192	F: ACACCCTTTCCAGGAATCGC	peroxidase 2-like，过氧化物酶，可被JA/SA诱导的与细胞过敏反应和细胞壁强化相关的基因
	R: GTGCCAATTCTTCAGCCACC

NCBI编号NCBI No.	引物序列（5ʹ–3ʹ）Primer sequence (5ʹ–3ʹ)	基因及其描述Genes and their descriptions
LOC111021666	F: CCCTCCCTCATGCAATTCTC	actin-7-like，肌动蛋白
	R: TCGGCAGTAGTGGTAAACATGTAAC
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	R: ACCAGAAACCCCAAGTGCTC
LOC111021192	F: ACACCCTTTCCAGGAATCGC	peroxidase 2-like，过氧化物酶，可被JA/SA诱导的与细胞过敏反应和细胞壁强化相关的基因
	R: GTGCCAATTCTTCAGCCACC

贝莱斯芽孢杆菌N46对苦瓜白粉病的防治机理研究

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项佳胤 ¹ , 商桑 ¹^,²^,^* , 田丽波 ²^,^*

热带作物学报 | 植物保护与生物安全 2024,45(6): 1292-1302

收起

热带作物学报 |植物保护与生物安全 2024 , 45 (6) : 1292 -1302

贝莱斯芽孢杆菌N46对苦瓜白粉病的防治机理研究

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项佳胤¹, 商桑¹^,²^,^*, 田丽波²^,^*

作者信息

^1.海南大学生命健康学院，海南海口　570228

^2.海南大学三亚南繁研究院，海南三亚　572000

通讯作者:

^* 商桑（SHANG Sang），E-mail：fair.play@163.com

田丽波（TIAN Libo），E-mail：faiy7play@163.com。

Control Mechanism of Bacillus velezensis N46 Against Powdery Mildew of Bitter Melon

Jiayin XIANG¹, Sang SHANG¹^,²^,^*, Libo TIAN²^,^*

Affiliations

^1.School of Life and Health Science, Hainan University, Haikou, Hainan 570228, China

^2.Sanya Research Institute, Hainan University, Sanya, Hainan 572000, China

出版时间: 2024-06-25 doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2024.06.021

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摘要

收起

为探究贝莱斯芽孢杆菌N46对苦瓜白粉病的防治机理，以前期分离得到的贝莱斯芽孢杆菌N46处理盆栽苦瓜，通过检测白粉病病原菌Podosphaera xanthii的孢子萌发率、叶片防御酶活性的变化、活性氧积累、细胞过敏性坏死、木质素积累、抗病相关基因表达量的变化以及抗病表现的依赖途径，开展N46的防治机理研究。结果表明：高浓度（6×10⁸ CFU/mL）的贝莱斯芽孢杆菌N46对苦瓜白粉病的防治效果达到59.05%；N46处理的苦瓜在病原菌侵染时其防御酶过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活性的变化幅度和峰值出现了大幅增加，活性氧（ROS）积累显著增加，过敏性坏死率显著提高，显著增强了细胞壁的木质素积累率，同时观察到N46对叶面白粉病病原菌孢子萌发有显著的抑制作用。本研究检测了经N46处理的苦瓜的抗病相关基因：茉莉酸（jasmonic acid，JA）反应性标记脂氧合酶基因（LOC111018837）、水杨酸（salicylic acid，SA）反应性标记基因（LOC111017362）、与过敏反应和细胞壁强化相关的过氧化物酶基因（LOC111021192）表达量的变化，与对照相比，这些基因在苦瓜被白粉病菌侵染时表达量显著增加，其中处理组的JA反应性标记基因在未接触病原菌时也高于对照组的表达水平。说明N46处理的苦瓜在未接触病原菌时即保持了一定水平的抗性基因的“预启动”，而在病原菌侵染时才出现更高的表达水平。通过布洛芬（IBU）抑制植株的JA反应途径，使贝莱斯芽孢杆菌N46对于苦瓜白粉病的防效几乎消失，表明N46诱导的苦瓜白粉病抗性的产生依赖于JA途径。综上所述，贝莱斯芽孢杆菌N46通过抑制叶面白粉病菌孢子萌发和诱导苦瓜产生依赖于JA途径的抗病性起到对苦瓜白粉病的良好防治效果。本研究为苦瓜白粉病的生物防治提供了新方法，为贝莱斯芽孢杆菌对苦瓜白粉病的防治作用提供理论依据。

关键词

贝莱斯芽孢杆菌 / 苦瓜白粉病 / 防治机理 / 诱导抗性

Abstract

收起

Potted bitter melon was treated with Bacillus velezensis N46 to explore the mechanism of preventing powdery mildew of bitter melon. The prevention mechanism of N46 was studied by detecting the spore germination rate of powdery mildew pathogen (Podosphaera xanthii), changes in leaf defense enzyme activity, accumulation of reactive oxygen species, cell allergic necrosis, lignin accumulation, changes in the expression of disease-resistance related genes and disease-resistance pathways. The control effect of high concentration (6×10⁸ CFU/mL) of B. velezensis N46 on powdery mildew of bitter melon reached 59.05%. In the N46 treatment group, the range and peak value of the activity of defense enzymes POD, CAT and SOD increased significantly, the accumulation of reactive oxygen species (ROS) increased significantly, the rate of anaphylactic necrosis increased significantly, and the rate of lignin accumulation in cell wall was significantly enhanced. N46 had a significant inhibitory effect on the conidial germination of pathogen powdery mildew. The expression levels of JA reactive marker lipoxygenase gene (LOC111018837), SA reactive marker gene (LOC111017362) and peroxidase gene (LOC111021192) associated with allergic reaction and cell wall strengthening were detected in the N46 treated bitter melon. Compared with the control group, the expression levels of the genes increased significantly when bitter melon was infected with the powdery mildew bacteria, and the expression levels of JA reactive marker genes in the treatment group were also higher than those in the control group when there was no contact with pathogenic bacteria. The results indicated that N46 treated bitter melon maintained a certain level of “preactivation” of resistance genes when it was not exposed to pathogenic bacteria, but showed a higher expression level when it was exposed to pathogenic bacteria. Finally, the JA response pathway was inhibited by ibuprofen (IBU), and the control effect of B. velesiensis N46 on powdery mildew of bitter melon was almost disappeared, suggesting that the generation of N46 induced powdery mildew resistance of bitter melon depended on JA pathway. In conclusion, B. velezensis N46 has a good control effect on powdery mildew of bitter melon by inhibiting the conidium germination of megalomycesfoliata and inducing JA pathway dependent resistance of bitter melon. This study would provide a new method for the biological control of powdery mildew of bitter melon and a theoretical basis for the effect of B. velezensis on the control of powdery mildew of bitter melon.

Key words

Bacillus velezensis / powdery mildew of bitter melon / control mechanism / induced systemic resistance

引用本文

项佳胤, 商桑, 田丽波. 贝莱斯芽孢杆菌N46对苦瓜白粉病的防治机理研究. 热带作物学报, 2024 , 45 (6) : 1292 -1302 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2024.06.021

Jiayin XIANG, Sang SHANG, Libo TIAN. Control Mechanism of Bacillus velezensis N46 Against Powdery Mildew of Bitter Melon[J]. Chinese Journal of Tropical Crops, 2024 , 45 (6) : 1292 -1302 . DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2024.06.021

正文

收起

苦瓜（Momordica charantia L.）作为一年生的葫芦科苦瓜属的蔬菜作物，广泛种植于亚洲和非洲的热带及温带地区^[1]，在我国尤其是南方地区广泛栽培^[2]，且栽培面积逐年上升。研究表明苦瓜含有高生物活性物质，具有良好的医药应用价值^[3]和较高的经济价值。

白粉病作为苦瓜生产中最为严重的病害之一，严重影响苦瓜的产量和品质，是苦瓜生产中亟待解决的重要问题。据统计，全世界范围内葫芦科白粉病的发病率在春秋两季高达90%，严重时可造成达40%的减产^[4]。单囊壳属（Sphaerotheca）的瓜类白粉病菌（Podosphaera xanthii）主要为害瓜类叶片，是苦瓜白粉病的最主要病原菌，白粉病菌的感染可引起叶片光合作用的降低，严重时会引起植株衰弱直至死亡。

目前对于白粉病的防治，仍以抗性品种的选育和使用农用化学杀菌剂为主。白粉病病原菌作为真核微生物有着较强的变异能力和适应性，降低了抗病品种选育的实用度^[5]，选育的抗病品种可能再次受到变异病原菌的侵害。而杀菌剂在面对有耐药性的白粉菌变异种时防治效果较低，过量使用农药还导致环境污染和严重的食品安全问题。目前对环境友好、有良好可持续性、安全性的生物防治逐渐成为防治白粉病的新趋势^[6]。

大量研究表明，植物伴生细菌或者土壤中的植物有益细菌可以作为调控植物根际土壤微环境^[6]和促进植物健康生长^[8]的试剂来使用。其中芽孢杆菌属（Bacillus）的众多微生物被发现具有生物防治潜力。芽孢杆菌属的生防菌主要通过直接抑制和间接抑制^[9]来控制植物病害。直接抑制主要是分泌对病原菌具有直接杀伤的代谢物质，但这些代谢物会在土壤中扩散，有较高的自然环境毒理风险，需要严格的风险评估。并且这些代谢物在抗击病原菌的区域浓度和持续时间上都是难以量化和控制的问题^[10]。而间接抑制主要是刺激植物产生诱导抗性（induced systemic resistance，ISR），另一种是由病原菌攻击引起的抗病性称为系统获得性抗性（systemic acquired resistance，SAR）。植物的抗病反应涉及植物活性氧积累、植物抗毒素的产生、酚类化合物和病程相关蛋白质的产生，还会在物理层面增加防御，比如植物细胞壁和角质层的加厚^[11]，这些增加抗性的生命活动均依赖于植物能量的消耗，SAR持续性的抗性维持导致高昂的能量成本。与SAR的抗性反应不同，ISR在非感染时期的预启动状态则允许植物在遭遇病原菌时以更快的速度更强地作出抗性反应，这将显著降低植物体的能源成本。通过微生物本身或释放的信号化合物诱导植物对病原体的抗性不会对病原菌有选择压力，这些微生物释放的信号化合物不直接与病原体相互作用，因此，不太可能导致病原菌对防治方式产生抵抗力^[12]，且以对植物抗性诱导为主要防治作用方式的微生物一般只考虑对人与动物的致病性，不需要考虑生态毒理的风险性，具有极好的应用前景。

贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）属于芽孢杆菌属，为革兰氏阳性好氧细菌，于2005年被首次报道和命名。据研究，贝莱斯芽孢杆菌对于植物致病细菌有良好的防治效果，已报道的包括防治番茄青枯病^[13]、治疗水稻白叶枯病^[14]，对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）表现出良好的抑制作用^[15]。抗真菌方面也有较好效果，对番茄早疫病菌（Alternaria solani）具有良好的抑制效果^[16]。研究还发现使用贝莱斯芽孢杆菌处理植物有明显的促生作用^[17]，对番茄植株的株高、茎粗、根系生长等生长参数均有显著提升^[18]，且贝莱斯芽孢杆菌处理土壤中植物有益微生物的丰度和种类均有提升^[19]。贝莱斯芽孢杆菌大多能引起植物产生诱导抗性，但需要达到一定浓度，且一般在根部较易诱导植物抗性，而在叶面的诱导能力因不同菌株而异^[20]。贝莱斯芽孢杆菌分布范围极广，繁殖速度快，极易存活，具有较高的生物安全性^[21]，有着优良的生物防治应用前景。

前人对于芽孢杆菌属微生物用于生物防治已有大量研究报道，但尚无利用贝莱斯芽孢杆菌防治苦瓜白粉病并明确其防治机理的研究。本研究通过实验室前期筛选获得的1株编号为N46的贝莱斯芽孢杆菌来探究其对苦瓜白粉病的防治效果。进一步通过检测病原菌孢子萌发率、苦瓜叶片防御酶活性变化、活性氧积累、细胞过敏性坏死、木质素积累、抗病相关基因的表达量变化和探究抗性反应作用途径来揭示拮抗菌对苦瓜白粉病的防治机理。为苦瓜生产中白粉病的防治提供新的方法，对于苦瓜生产具有十分重要的意义。

1　材料与方法

收起

1.1　材料

贝莱斯芽孢杆菌N46：由本实验室筛选、编号、鉴定并保存。

病原菌：苦瓜白粉病病原菌（Podosphaera xanthii）由本实验室分离、纯化并保存。

植物材料：苦瓜纯合品系25-15，由本实验室保存、提供。

1.2　方法

1.2.1　贝莱斯芽孢杆菌N46培养条件

培养基配比为牛肉膏0.93%、酵母提取物0.52%、氯化钠0.50%，环境条件：摇床转速为220 r/min，装液量为35%，接种量为5%，初始pH为6，培养温度为32 ℃，培养时间为24 h。

1.2.2　贝莱斯芽孢杆菌N46菌悬液制备

以1.2.1培养条件对N46进行培养。对所得发酵液常温4000 r/min离心10 min，弃上清液，以无菌水重悬，测定菌悬液的活菌浓度，并稀释至6×10⁸、6×10⁷、6×10⁶ CFU/mL，置于4 ℃保存，备用。

1.2.3　N46对苦瓜白粉病的防治效果测定

（1）苦瓜苗处理。取苦瓜纯合品系25-15的种子，种子表面使用75%乙醇浸泡消毒3 min，去除残余乙醇，置于55 ℃水浴20 min后取出，30 ℃浸种24 h后催芽，环境温度为30 ℃。待苦瓜长至7日龄，选取长势一致的苦瓜苗，对叶面及根部喷施N46菌悬液共10 mL，每2 d喷施1次，共施用3次。试验设置3个N46菌悬液处理：6×10⁸ CFU/mL（T₁）；6×10⁷ CFU/mL（T₂）；6×10⁶ CFU/mL（T₃）。以施用无菌水为阴性对照组（CK^-），施用250 mg/L三唑酮溶液为阳性对照组（CK⁺）。每个处理组10株苗，重复3次。

（2）白粉病病原菌接种。待上述处理的苦瓜叶片晾干后，用0.05% Tween-20溶液配制成浓度为1×10⁶个/mL的新鲜白粉病菌孢子悬浮液，并均匀喷施在苦瓜苗叶片上完成病原菌接种。

（3）苦瓜叶片白粉病病情分级标准及相对防治率计算。接种病原菌10 d后，统计各处理组中所有植株的第1、2片真叶，参考GB/T 17980.30—2000《农药田间药效试验准则（一）杀菌剂防治黄瓜白粉病》的分级标准（表1）。

病情指数计算公式如下：

相对防治效果计算公式如下：

1.2.4　N46对苦瓜白粉病的防治机理研究

（1）苦瓜防御酶活性测定。将待测苦瓜分为4个处理组：仅喷施无菌水的健康对照组（CK）；喷施6×10⁸ CFU/mL N46菌悬液的实验组（N46）；N46菌悬液处理后再接种病原菌的实验组（N46+病原菌）；喷施等量无菌水后再接种病原菌的阳性对照组（病原菌）。对这些处理组在接种白粉病病原菌孢子后的0、24、48、72、96 h分别取样，每个处理组5株苗，重复3次。参考汪茜等^[22]的方法对苦瓜叶片的过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）活性进行测定。

（2）苦瓜叶片活性氧（ROS）积累测定。对N46处理组和CK喷施接种白粉病病原菌孢子悬浮液，接种24、48、72、96 h后分别随机取3株苦瓜的同一叶位的3片叶子，采用二氨基联苯胺（DAB）染色法进行活性氧积累的检测。叶片以DAB染色后80 ℃下无水乙醇脱色10 min，观察记录叶片出现的红褐色区域，以叶片出现红褐色区域占叶片总面积的百分比作为该叶片活性氧积累率。计算公式如下：

（3）白粉病菌孢子萌发率及苦瓜叶片细胞过敏性坏死测定。以台盼蓝（TPB）染色观察和统计苦瓜叶片上白粉病菌孢子的萌发率和叶片细胞过敏性坏死的情况。对N46处理组和CK喷施接种白粉病菌孢子悬浮液，接种0、24、48、72、96 h后分别取样，叶片以TPB染色后于80 ℃下无水乙醇脱色10 min，取出叶片用显微镜观察。排除0 h时已萌发的孢子后再统计接种24 h时的叶面孢子萌发数，每个处理组随机取5株苦瓜的同一叶位的2片叶子进行统计，每组叶片统计500个孢子，计算白粉病菌孢子在24 h的孢子萌发率。每片叶片随机统计30个互作点，以互作点呈现蓝色区域数占统计总数的百分比作为该叶片细胞过敏性坏死率。计算公式如下：

（4）苦瓜叶片木质素沉积测定。用甲苯胺蓝染料对脱色后的苦瓜叶片进行染色，观察拮抗菌对植物与病原菌互作点处的木质素沉积情况。对N46处理组和CK喷施接种白粉病菌孢子悬浮液，接种24、48、72、96 h后分别随机取3株苦瓜的3片叶子，样品叶片以无水乙醇脱色后，置于1%甲苯胺蓝染料至没过叶片，避光浸泡12 h，用蒸馏水漂洗去染料后使用显微镜观察植物与病原菌互作点的情况，每片叶片随机统计30个互作点，以互作点呈现蓝紫色区域数占统计总数的百分比作为该叶片病理互作点木质素积累率。计算公式如下：

（5）苦瓜抗病调控基因表达的测定。对N46处理组和CK喷施接种白粉病菌孢子悬浮液，接种0、24、48、72、96 h后分别取3株苦瓜第1、2片真叶作为提取RNA样品。提取RNA后使用NOVA逆转录试剂盒对样品RNA进行反转录获取cDNA，以反转录得到的苦瓜叶样品cDNA为模板，以肌动蛋白基因（actin-7-like，LOC111021666）为内参基因，参考GARCÍA-GUTIÉRREZ等^[23]在葫芦科植物甜瓜中检测的植物抗病有关的标记性基因，在NCBI中进行氨基酸序列比对以获得苦瓜的同源基因，对其进行qRT-PCR检测，试验所用引物见表2。使用qPCR仪（Appliedbiosystems，赛默飞）进行荧光定量试验，样品qPCR所用试剂盒MonAmpChemoHS qPCR Mix由Monad公司提供。每个处理3次生物学重复。使用相对定量计算法对仪器测得的Ct值采用2^-ΔΔC_T法计算。

（6）阻断茉莉酸（JA）途径对N46诱导苦瓜抗病性的影响。布洛芬（IBU）作为JA合成抑制剂可以阻断JA途径介导的抗病反应，可作为探究N46对苦瓜抗病性的诱导途径。在接种病原菌前24 h以5 mmol/L IBU溶液涂于苦瓜第1、2片真叶。苦瓜苗的预处理同1.2.3-（1）。设置4种处理：无菌水处理后再接种病原菌（A₁）；无菌水处理后涂抹IBU，再接种病原菌（A₂）；N46菌悬液处理后再接种病原菌（A₃）；N46菌悬液处理后涂抹IBU，再接种病原菌（A₄）。14 h光照10 h黑暗循环处理，培养10 d叶片发病后观察记录接种病原菌叶片的病叶级数，并计算植株病情指数。每个处理10株苗，每组重复3次。

1.3　数据处理

采用SPSS 20.0和Microsoft Excel 2013软件对试验数据进行处理分析和制作图表；采用Duncan’s新复极差法检验不同处理间的差异显著性。

2　结果与分析

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2.1　贝莱斯芽孢杆菌N46对苦瓜白粉病的防治效果

由图1、图2可以看出，随着贝莱斯芽孢杆菌N46活菌浓度的增加，对苦瓜白粉病菌的防治效果逐步提升。接种白粉病菌10 d时，CK^-对白粉病的防治效果为0%，三唑酮处理（CK⁺）的相对防治效果为57.43%，T₁、T₂、T₃处理对苦瓜白粉病的相对防治效果分别为59.05%、33.65%、15.24%。表明T₁处理对苦瓜白粉病有较好的相对防治效果，与市售真菌杀菌剂三唑酮的防治效果无显著差异。

2.2　贝莱斯芽孢杆菌N46对苦瓜白粉病的防治机理

2.2.1　N46处理对苦瓜防御酶活性的影响

由图3可知，与未接种病原菌处理相比，接种病原菌的2个处理的POD活性在接种48、72、96 h出现大幅提高且差异显著（P<0.05）。其中N46+病原菌处理的POD活性的变化幅度和活性峰值均显著高于仅接种病原菌处理组，在接种72 h达到峰值153.35 U/g，比仅接种病原菌处理组高41.50%，并且与仅接种病原菌处理组差异显著（P<0.05）。

由图4可知，与未接种病原菌处理相比，接种病原菌的2个处理的CAT活性在接种48、72、96 h出现大幅提高且差异显著（P<0.05）。N46+病原菌处理在48 h出现CAT活性显著增高，酶活性峰值比仅接种病原菌处理提高了约57.00%，在48~96 h间接种病原菌的2个处理的CAT活性变化幅度和峰值均有显著差异（P<0.05）。

由图5可知，仅接种病原菌的处理在48 h时出现SOD活性增加，与CK差异显著（P<0.05），但酶活性增幅较小，且在96 h出现酶活性下降；N46+病原菌处理的SOD活性在48 h出现显著增高（P<0.05），于72 h达到峰值，比仅接种病原菌处理提高了约53.00%，且96 h时酶活性下降不明显。

2.2.2　N46处理对苦瓜活性氧积累的影响

由图6可知，N46处理和CK的活性氧积累均随接种时间的延长而增加，接种24 h时活性氧积累率分别为4.30%和2.50%，48 h起产生了较高的活性氧积累，CK在接种48、72、96 h的活性氧积累率分别为15.60%、25.60%、27.80%，N46处理的活性氧积累率在接种48、72、96 h分别为27.80%、41.10%、45.10%，与CK均有显著差异（P<0.05）。

2.2.3　N46处理对白粉菌分生孢子萌发及苦瓜叶片细胞过敏性坏死的影响

通过TPB染色观察和统计苦瓜叶片上白粉菌分生孢子的萌发率和叶片细胞过敏性坏死的情况。结果表明，接种24 h时，CK叶面孢子萌发率为30.67%，与N46处理的孢子萌发率（18.80%）差异显著（P<0.05）。

由图7、图8可知，各处理的叶片细胞过敏性坏死率均随接种时间的延长而增加。接种24 h时，CK和N46处理的叶片细胞过敏性坏死率均较低，在3.00%以下；接种48 h时，CK和N46处理分别为11.00%和22.00%，二者差异显著（P<0.05）。接种72 h时，N46处理的过敏性坏死率达到峰值30.00%，且在96 h时无明显下降。而CK在接种48、72、96 h的坏死率均无显著差异，最高仅14.00%，而与N46处理差异显著（P<0.05）。

2.2.4　N46处理对苦瓜木质素沉积的影响

以甲苯胺蓝对脱色苦瓜叶片进行染色，观察病原菌与植物互作处的木质素积累情况。结果表明，接种24 h时，N46处理和CK均未观察到因木质素积累而被染色的区域；接种48~96 h，N46处理和CK的木质素积累率均逐渐升高，CK的木质素积累率分别为5.70%、12.30%、14.60%，而接种48 h时，N46处理组的木质素积累率即有35.70%，72 h时达到68.70%，96 h时达到最高值92.60%。各时期N46处理和CK的木质素积累率均有显著差异（P<0.05），且与CK相比，N46处理木质素积累染色显示区域更大、染色程度更深，表明其在互作点的木质素积累量更大（图9，图10）。

2.2.5　N46对苦瓜抗病调控基因的影响

利用qRT-PCR技术对苦瓜调控抗病关键基因的表达量进行测定，结果表明，未接触病原菌的0 h时，N46处理的JA反应应答的标记性基因（LOC1110--18837，linoleate 9S-lipoxygenase 6-like）的表达量约为CK的4.7倍，二者差异显著（P<0.05）；接种病原菌24 h时，N46处理的表达量达到峰值，为CK的2.7倍，之后随接种时间的延长N46处理的表达水平逐渐下降；各时期CK的表达量均低于N46处理组，二者均差异显著（P<0.05，图11A）。

由图11B可知，接种48 h时，N46处理的SA反应应答的标记性基因（LOC111017362，pathogenesis-related protein PR-1 type-like）的表达水平出现大幅上调，接种72 h时出现峰值，接种48~96 h N46处理的表达量与CK均呈显著差异（P<0.05）

由图11C可看出，接种48 h时，N46处理的由JA/SA诱导的与过敏反应和细胞壁强化相关的基因（LOC111021192，peroxidase 2-like）的表达水平出现大幅上调，并在接种72 h达到峰值，比CK高8.6倍，在接种96 h时略有下降，但仍比CK高8.7倍。各时期CK的表达水平均较低，接种48~96 h CK的表达水平与N46处理均呈显著差异（P<0.05）。

2.2.6　阻断JA途径对N46诱导苦瓜抗病性的影响

对N46处理后的苦瓜使用IBU阻断JA途径，探究菌N46作用于苦瓜产生抗性诱导的依赖途径，结果如图12所示。施用无菌水再接种病原菌（A₁）的病情指数为83，与仅施用IBU处理组（A₂）和施用N46后涂抹IBU再接种病原菌（A₄）处理组的病情指数无显著差异，而N46处理的苦瓜病情指数仅39，与其他处理均呈差异显著（P<0.05）。

3　讨论

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因白粉病菌具有变异快、适应性强的生物学特性，抗病育种和化学农药均面临着难以继续控制病害的局面。环保、可持续、高潜力的生物防治措施或将是未来的最佳选择。

近年来，芽孢杆菌属微生物作为生物防治的热点研究菌群，越来越多地被用于各种植物病害的控制。冉继平等^[24]从植物根际土壤中筛选到2株对刺梨白粉病具有突出防治效果的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）和空气芽孢杆菌（B. aerius）。谢德珊^[25]研究发现枯草芽孢杆菌对小麦白粉病有良好的控制效果，在高浓度下的防效超过市售农药三唑酮，且对植物有较好的促生效果。杨东亚等^[26]发现解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌（B. subtilis）对黄瓜茄病镰刀菌（Fusarium solani）具有良好的抑制效果。本研究中，贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis）N46在6×10⁸ CFU/mL浓度时对苦瓜白粉病具有显著的防治效果，与上述研究结果较为相似。

杨胜清等^[16]研究发现贝莱斯芽孢杆菌对植物病害的防治主要有直接作用（抑菌物质的分泌）和间接作用（诱导植物抗性）2种方式。由于分泌的抗菌物质本质与化学农药无太大区别，且已有较多研究阐述，本研究的关注点集中在贝莱斯芽孢杆菌使植物产生的诱导抗性。本研究发现，贝莱斯芽孢杆菌N46处理的苦瓜防御酶POD、CAT和SOD的活性在接种病原菌48 h时，出现大幅增加，且显著高于CK。前期的研究表明，N46处理能有效防控白粉病在苦瓜上的发生，而进一步研究表明，N46处理对苦瓜防御酶活性的变化幅度也显著提高。这与前人研究发现的植物防御酶POD、CAT、SOD的活性高低及变化幅度在苦瓜中与其对白粉病的抗性呈正相关的规律^[27]相吻合，与其他研究者在番茄作物上以芽孢杆菌处理植物获得的规律^[28]类似。表明N46处理对苦瓜白粉病的良好防治效果有一部分来源于植物的防御酶响应变化的提升。本研究还观察到N46处理的苦瓜在接种白粉病菌时比CK有更高的活性氧（ROS）积累率，而ROS在植物抗病中有着至关重要的作用，包括直接杀死病原菌、氧化交联提高细胞壁强度、造成细胞过敏性坏死等^[29]。被侵染的植物细胞过敏性坏死并强化周边细胞的细胞壁可以有效阻止病害的传播，这是植物抗病能力的表现。N46处理的过敏性坏死率显著高于CK。木质素沉积能使植物在受到病原菌侵害时加强细胞壁结构，限制病原菌的活动范围，从而阻止病原菌的扩散。甲苯胺蓝染色后观察到N46处理的木质素积累率远高于CK，与白红燕等^[30]使用贝莱斯芽孢杆菌处理棉花作物时的表现类似。

本研究通过qRT-PCR技术检测了抗病途径相关基因的表达水平，N46处理的JA反应应答的标记性基因（LOC111018837）、SA反应应答的标记性基因（LOC111017362）、由JA/SA诱导的与过敏反应和细胞壁强化相关基因（LOC111021192）的表达量高于CK。N46处理的JA反应应答的标记性基因表达量在0 h即与CK呈显著差异，表明N46处理的苦瓜在未接触病原菌时即保持了一定水平的抗性基因表达，但在本研究测定的生理生化指标中并未表现出明显差异，且在被病原菌侵染时抗病相关基因的表达量更高。这样的“预启动”效果在葫芦科甜瓜作物^[23]的诱导抗性研究中发现有类似的表现，“预启动”不同于使植物一直保持高水平的防御动作，“预启动”使植物仅在面对病原菌侵害时才触发植物防御动作，且比未经抗性诱导的植物反应更快、更强。通过抑制JA反应途径使N46对苦瓜白粉病的防效几乎消失，其染病严重程度与CK无显著区别。这些结果表明依赖植物的JA途径产生N46诱导的苦瓜抗病性，与在模式植物拟南芥^[31]上得出的结论一致。而在抗病过程中也会使SA途径的抗病性增强，所以N46使苦瓜对白粉病抗病性提高是JA途径与SA途径协同作用的结果。进一步探究引起苦瓜抗病性的信号分子、植物细胞表面受体及其植物体中的信号转导，深入完整地揭示生物防治的作用机理是下一步的研究方向和目标。

本研究通过盆栽苦瓜测定并确认了贝莱斯芽孢杆菌N46对苦瓜白粉病的良好防治效果，进一步探究了其防治机理，研究表明贝莱斯芽孢杆菌N46通过抑制叶面白粉病孢子萌发和诱导苦瓜叶片产生依赖于JA途径的抗病性起到对白粉病的防治效果。

基金

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国家自然科学基金项目(32060682)
海南省重大科技计划项目(ZDKJ2021010)
海南省自然科学基金项目(322RC576)

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2024年第45卷第6期

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文章信息

doi: 10.3969/j.issn.1000-2561.2024.06.021

接收时间：2023-04-12
首发时间：2026-06-24
出版时间：2024-06-25

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出版历史

收稿日期：2023-04-12
修回日期：2023-05-26

基金

国家自然科学基金项目(32060682)

海南省重大科技计划项目(ZDKJ2021010)

海南省自然科学基金项目(322RC576)

作者信息

^1.海南大学生命健康学院，海南海口　570228

^2.海南大学三亚南繁研究院，海南三亚　572000

通讯作者:

^* 商桑（SHANG Sang），E-mail：fair.play@163.com

田丽波（TIAN Libo），E-mail：faiy7play@163.com。

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https://castjournals.cast.org.cn/joweb/rdzwxb/CN/10.3969/j.issn.1000-2561.2024.06.021

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2种不同金属材料的力学参数

科 Family	属数 Number of genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)	属 Genus	种数 Number of species	占总种数比例 Percentage of total species (%)
鹅膏菌科Amanitaceae	2	11	5.26	鹅膏菌属 Amanita	10	4.78
小菇科 Mycenaceae	2	12	5.74	丝盖伞属 Inocybe	5	2.39
多孔菌科 Polyporaceae	8	14	6.70	蜡蘑属 Laccaria	5	2.39
红菇科 Russulaceae	3	23	11.00	小皮伞属 Marasmius	6	2.87
				小菇属 Mycena	11	5.26
				光柄菇属 Pluteus	5	2.39
				红菇属 Russula	17	8.13
				栓菌属 Trametes	5	2.39

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